Лабораторная работа № 2
Тема: МОРФОЛОГИЯ ГРИБОВ – КОНТАМИНАНТОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА
Цель работы: освоение методов приготовления и микроскопии препаратов грибов; изучение морфологических особенностей грибов (зигомицетов, аскомицетов и базидиомицетов), их значения в фармацевтическом производстве и медицине фармации.
Вопросы для обсуждения
1. Характеристика грибов как эукариотических микроорганизмов. Принципы классификации грибов. Особенности микроморфологии, строение и видоизменения мицелия, способы размножения грибов.
2. Характеристика низших грибов (хитридиомицетов, оомицетов, зигомицетов).
3. Характеристика аскомицетов и базидиомицетов, особенности морфологии и размножения.
4. Распространение грибов в природе, значение их как контаминантов фармацевтического производства и роль в возникновении микозов и микотоксикозов. Фитопатогенные представители грибов.
5. Питательные среды для культивирования микроорганизмов.
Информационный блок
Грибы являются эукариотическими организмами, относящимися к царству Mycota. Основной морфологической структурой многих микроскопических грибов (микромицетов) является мицелий, состоящий из ветвящихся гиф. Грибы, которые имеют несептированный мицелий, условно относят к низшим (представители отделов Chytridiomycota, Oomycota, Zygomycota). Высшие грибы характеризуются наличием многоклеточного (септированного) мицелия (Ascomycota, Basidiomycota). Некоторые грибы не формируют мицелия, а существуют в виде отдельных клеток; такие грибы называют дрожжами. Диморфные грибы в зависимости от условий окружающей среды могут существовать либо в виде дрожжевых клеток, либо образовывать мицелий.
Грибы могут размножаться вегетативно, а также бесполым репродуктивным и половым путем. Вегетативное размножение грибов происходит с помощью неспециализированных структур (например, фрагментов мицелия, у дрожжей – почкования). Репродуктивное размножение (половое или бесполое) предполагает образование структур, единственной функцией которых служит участие в процессе размножения. Все структуры, которые имеют отношение к бесполой стадии развития гриба, называют анаморфой, имеющие отношение к половой фазе – телеоморфой. Грибы, имеющие телеоморфу, являются совершенными. Способность к половому размножению выявлена не у всех грибов. Грибы, у которых телеоморфа отсутствует или не обнаружена, относятся к несовершенным. Высшие несовершенные грибы, размножающиеся только в результате митоза, называются митоспоромицетами.
В основу классификации грибов положены филогенетическое родство, особенности микроморфологии и размножения.
Хитридиомицеты и оомицеты – низшие совершенные грибы, обитающие во влажных средах (вода, влажная почва, растения). Среди них встречаются фитопатогенные микроорганизмы, в частности грибы родов Synchytrium (вызывают рак картофеля) и Phytophthora (вызывают фитофтороз, преимущественно у растений семейства Паслёновых – томата, картофеля и др.).
Представители отдела Zygomycota (зигомицеты) – низшие совершенные грибы, в основном обитающие в почве. На стадии анаморфы большинство из них образует эндоспоры (спорангиеспоры), находящиеся в специальных вместилищах – спорангиях, которые располагаются на спорангиеносцах (например, представители родов Mucor, Rhizopus, Absidia, рис. 3, А). Половой процесс у зигомицетов приводит к образованию зигоспоры. Для вегетативного мицелия зигомицетов характерны такие видоизменения, как столоны (служат для распространения гриба по субстрату), ризоиды (используются для прикрепления к субстрату и для транспорта питательных веществ, если субстрат их содержит), хламидоспоры (способствуют переживанию неблагоприятных условий и, попутно, вегетативному размножению).
Грибы отдела Basidiomycota относятся к высшим грибам, некоторые на стадии анаморфы существуют в виде дрожжевых клеток. Результатом полового размножения у базидиомицетов является формирование гаплоидных базидиоспор, находящихся на базидиях. У ряда грибов, филогенетически родственных базидиомицетам, не обнаружено телеоморфы (многие дрожжи родов Rhodotorula и Cryptococcus, широко распространённые на растениях, в почве, воде). Некоторые мицелиальные базидиомицеты вызывают заболевания растений (ржавчину, головню).
Представители отдела Ascomycota являются высшими грибами, которые на стадии телеоморфы образуют сумку (аск) с гаплоидными аскоспорами.
Бесполое репродуктивное размножение большинства мицелиальных аскомицетов осуществляется экзоспорами (конидиями), которые могут быть многоклеточными (макроконидии) или одноклеточными. Образование
Рис. 3. Морфологические особенности некоторых грибов – контаминантов фармацевтического производства. А – Mucor sp. (1 – спорангий, 2 – эндоспоры, 3 – колонка, 4 – спорангиеносец, 5 – несептированный мицелий); Б – Aspergillus sp. (1 – конидии, 2 – стеригмы, 3 – головчатое расширение на конце конидиеносца, 4 – несептированный конидиеносец, 5 – опорная клетка); В – Penicillium sp. ( 1 – конидии, 2 – стеригмы, 3 – септированный конидиеносец, 4 – септированный мицелий); Г – Candida sp. (1 – псевдомицелий, 2 – почкующиеся дрожжевые клетки).
макроконидий характерно для фитопатогенных аскомицетов родов Fusarium, Stemphylium, Trichothecium и ряда других.
Наиболее известными аскомицетами, формирующими хорошо развитый септированный мицелий, являются грибы родов Aspergillus и Penicillium. Виды рода Aspergillus на стадии анаморфы образуют несептированные конидиеносцы, которые заканчиваются головчатым расширением различной формы со стеригмами и одноклеточными конидиями (рис. 3, Б). Для анаморфы Penicillium spp. характерно образование кисточек (симметричных или асимметричных) с 1–3 рядами стеригм и одноклеточными конидиями; конидиеносец у пенициллов септированный (рис. 3, В). У многих грибов этих родов (в частности, A. niger) телеоморфа не обнаружена.
Ряд мицелиальных аскомицетов (в частности, представители родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps и некоторых других) образуют микотоксины. При попадании в организм человека (например, с пищевыми продуктами или лекарственными препаратами, контаминированными токсинообразующими грибами) микотоксины могут проявлять гепатотоксическое (негативное действие на печень), нефротоксическое (действие на почки), нейротоксическое (действие на клетки нервной системы), мутагенное, канцерогенное действие.
Ряд аскомицетов существуют в дрожжевой форме. Наиболее известным представителем аскомицетных дрожжей является Saccharomyces cerevisiae – хлебопекарные (винные, пивные) дрожжи. Дрожжи-аскомицеты рода Cаndida, как правило, телеоморфы не имеют, а на стадии анаморфы формируют дрожжевые почкующиеся клетки и псевдомицелий (рис. 3, Г). C. albicans является представителем нормальной микробиоты тела человека (живёт в небольших количествах в кишечнике, на коже, слизистых оболочках), однако патогенна и при определённых условиях (прежде всего, при ослаблении иммунитета) может вызывать заболевания (кандидозы кожи, ротовой полости, менингиты, пневмонии, сепсис и др.).
Питательные среды для культивирования микроорганизмов
Питательные среды для культивирования микроорганизмов должны содержать все необходимые для жизнедеятельности химические элементы в легко усваиваемой форме, из которых клетка строит свои молекулы и получает энергию. Для разных микроорганизмов готовят различные по составу и назначению питательные среды.
Питательные среды классифицируют по консистенции, составу (происхождению), целевому назначению. Они должны отвечать ряду требований, реализация которых обеспечивает рост микроорганизмов:
– должны содержать все необходимые для роста и размножения компоненты в оптимальных соотношениях;
– иметь достаточную влажность;
– иметь оптимальное значение рН;
– должны быть изотоническими для клеток микроорганизмов и обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом;
– должны быть стерильными.
По составу среды подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. Для приготовления естественных питательных сред используют натуральные продукты животного или растительного происхождения – молоко, овощи (например, картофель), животные ткани, желчь, сыворотку крови. Искусственные среды готовят по определенным рецептам из экстрактов животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов или азотсодержащих веществ. Примерами искусственных питательных сред являются МПБ (мясопептонный бульон), МПА (мясопептонный агар). Синтетические среды содержат определенные химические соединения в точно указанных концентрациях (например, среда Сабурó для культивирования грибов).
По консистенции среды бывают жидкие, полужидкие, плотные и сыпучие. Жидкие среды используют для изучения физиолого-биохимических особенностей микробов, для накопления биомассы клеток и продуктов метаболизма. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур. Плотные среды применяют для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний (макроморфологии), количественного учета жизнеспособных клеток микроорганизмов. В качестве уплотнителя питательных сред обычно используют агар-агар. Агар-агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей; большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного вещества. Он способен набухать в воде и образовывать гели различной плотности в зависимости от концентрации. Гели агар-агара плавятся при 100оС и затвердевают при 45оС и ниже. Для приготовления полужидких и плотных питательных сред агар-агар добавляют в среды в концентрациях 0,5% и 1,5–2% соответственно. Сыпучие среды обычно используют для хранения посевного материала культур продуцентов биологически активных веществ в микробиологической промышленности.
В промышленности выпускают готовые сухие питательные среды, содержащие все необходимые компоненты для роста определенных микроорганизмов. Их преимуществами являются стандартность, простота хранения и транспортировки, простота приготовления в соответствии с указанными инструкциями по применению. Эти среды представляют собой гигроскопичные порошки с влажностью до 10% в специальных герметичных упаковках.
По назначению среды подразделяют на универсальные (простые), специальные, элективные и дифференциально-диагностические.
Универсальные среды используют для культивирования большинства микроорганизмов, к ним относятся МПБ, МПА – для бактерий; среда Сабуро – для грибов.
Специальные среды используют для выделения и культивирования определенных групп или видов микроорганизмов, например МПБ с глюкозой или плазмой крови для культивирования стрептококков.
Элективные среды используют для выделения определённого вида или группы микробов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. При этом создаются условия преимущественного роста целевых микроорганизмов, в то время как сопутствующие микроорганизмы не растут или их развитие существенно задерживается. Например, при добавлении в питательную среду красителя малахитового зеленого подавляется рост грамположительных бактерий, при этом создаются условия для размножения энтеробактерий, что используется при их выявлении в нестерильных лекарственных препаратах (НЛП) и субстанциях.
Дифференциально-диагностические среды применяют для разделения (дифференцирования) одного вида микроорганизма от другого по их биохимическим свойствам (ферментативной активности). Такой средой, например, является среда Эндо, в состав которой входят пептон (источник азота), лактоза (источник углерода) и индикатор основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Изначально питательная среда Эндо окрашена в светло-розовый цвет. При росте на среде Эндо бактерий, утилизирующих лактозу, например кишечной палочки, в качестве продукта метаболизма лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом натрия, при этом высвобождается ранее связанный фуксин, а колонии, выросшие на данной среде, окрашиваются в ярко-малиновый цвет и часто приобретают металлический блеск. Бактерии, не способные ферментировать лактозу (сальмонеллы, шигеллы), растут на среде Эндо в виде бесцветных или бледно-розовых колоний. Таким образом, данная среда позволяет дифференцировать (отличить) патогенные кишечные бактерии от кишечной палочки – представителя нормальной микробиоты кишечника человека. Кроме среды Эндо, в качестве примеров дифференциально-диагностических сред также можно привести среду с маннитом для идентификации золотистого стафилококка в НЛП (по способности ферментировать маннит с образованием кислот) и среду с глицерином для выявления синегнойной палочки (по способности образовывать пигмент пиоцианин).