Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Генетика_Электронный конспект.docx
Скачиваний:
26
Добавлен:
08.09.2023
Размер:
261.09 Кб
Скачать

3.2 Опыты с. Бензера (1961) на бактериофаге т4, доказывающие мутационную и рекомбинационную делимость гена. Метод перекрывающихся делеций. Функциональный тест на аллелизм – цис-транс-тест

Одно из наиболее существенных достижений молекулярной генетики заключалось в установлении минимальных размеров участков гена, передающихся при кроссинговере, подвергающихся мутации и осуществляющих одну фракцию. Оценки этих величин были получены в 50-е годы С. Бензером при изучении так называемых rII-мутаций бактериофага Т4, поражающего кишечную палочку – Е. coli. Эти мутанты дают быстро формирующиеся негативные колонии (бляшки) на бактериальном газоне (отсюда и происхождение термина r-мутанты - от английского слова rapidly).

Бензер разработал удобный тест для разделения r-мутантов на три группы (rI, rII и rШ) по способности образовывать бляшки определенной формы на различных линиях Е. coli. В частности, те r-мутанты, которые дают большие, круглые, прозрачные бляшки на линии Е. coli В и не дают бляшек вовсе на Е. coli K12 (λ), являются rII-мутантами. Очевидно, это позволяет предельно просто выделять из популяции rII фагов все обратные мутанты, т. е. восстановившие свою способность лизировать клетки Е. coli K12 (λ).

Выделив несколько сотен rII-мутантов, Бензер для построения генетических карт предпринял всевозможные скрещивания их между собой. Основой для картирования служил широко применяемый в классической (а теперь и в молекулярной) генетике метод трехфакторного скрещивания (метод трех точек). В результате Бензеру удалось с большой точностью расположить в пределах одного rII-гена несколько сотен различных мутаций.

Среди различных внутригенных мутаций Бензер выделил два класса: точечные мутации (мутации минимальной протяженности) и делеции (мутации, занимающие достаточно широкую область гена). Одно из предположений о природе делеций (нехваток) основывалось на признании возможности выпадения последовательности нуклеотидов в молекуле той или иной длины. То, что делеции на самом деле обусловлены выпадением участков ДНК, было доказано впоследствии различными способами (Е. Буржи, В. Шибальский и др.). Если в классической генетике считалось, что делеции могут возникать только на хромосомном уровне, то теперь стало ясно, что такие мутации существуют и на внутригенном уровне. Кстати, именно делеции и позволили Бензеру резко ускорить процесс картирования мутаций.

Имея набор делеций, отражающих выпадение участков молекулы ДНК, имеющих разную длину, Бензер пользовался ими как своеобразными линейками для определения локализации картируемого гена.

Установив факт существования точечных мутаций, Бензер задался целью определить минимальную длину участка ДНК, передаваемую при рекомбинации. Оказалось, что эта величина составляет не более нескольких нуклеотидов, т. е. нескольких мономеров полимерной молекулы ДНК. Бензер назвал эту величину реконом. В дальнейшем Ч. Яновский (1964) показал, что рекомбинации могут происходить между смежными парами нуклеотидов в цепях ДНК. Следующим этапом было установление минимальной длины участка, изменения которого достаточно для возникновения мутации, иными словами, определение минимального размера точечной мутации (мутона). По мнению Бензера, эта величина равна нескольким нуклеотидам. Однако последующими тщательными определениями было выявлено, что длина одного мутона не превышает размеров одного нуклеотида.

Оставалось выяснить, что представляет собой на молекулярном уровне третья характеристика гена – управление одной функцией. Для решения этого вопроса Бензер воспользовался ранее разработанным цис-транс-тестом, применив его к вирусам. Этот метод состоит в следующем. Требуется узнать, одинаковые или разные функциональные единицы затронуты у двух мутантов. Для этого первый раз мутации используются в транс-положении, т. е. когда каждая из них расположена в разных гомологичных хромосомах, а второй раз – в цис-положении, когда обе находятся в одной гомологичной хромосоме и вторая при этом нормальна. Если при транс-положении обе мутации принадлежат одной функциональной единице, то эти единицы в обеих хромосомах будут повреждены.

Если же мутации принадлежат двум разным функциональным единицам, то на первой хромосоме будет работать не затронутая мутацией вторая функциональная единица, а на второй хромосоме будет работать нормальная первая функциональная единица.

Пользуясь этим методом, можно вывести заключение о функциональных единицах, участвующих в формировании данного признака. Сравнивая результаты, полученные в обоих случаях, с результатами экспериментов с мутациями в цис-положении, можно точно сказать, затронута ли мутацией одна и та же или же разные функциональные единицы. Данный метод позволил Бензеру охарактеризовать все обнаруженные им rII-мутанты и доказать, что они относятся к двум функциональным единицам. Сами единицы он назвал цистронами. Расчет показал, что в цистрон может входить около тысячи нуклеотидов.