4.2 Рестрикция-модификация днк

Система рестрикции-модификации – ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция – защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности – метилтрансферазная (метилазная) и эндонуклеазная. За каждую из них могут отвечать как отдельные белки, так и один белок, сочетающий в себе обе функции.

Система рестрикции-модификации (СР-М) специфична по отношению к определённым последовательностям нуклеотидов в ДНК, называемых сайтами рестрикции. Если определённые нуклеотиды в последовательности не метилированы, эндонуклеаза рестрикции вносит в ДНК двуцепочечный разрыв (часто — со смещением на несколько нуклеотидов между цепями), при этом биологическая роль молекулы ДНК нарушается. В случае, когда метилирована только одна из цепей ДНК, расщепления не происходит, вместо этого метилтрансфераза добавляет метильные группы к нуклеотидам второй цепи. Подобная специфичность СР-М позволяет бактериям проводить селективное расщепление чужеродной ДНК, не затрагивая собственную. В норме вся ДНК в бактериальной клетке либо полностью метилирована, либо полностью метилирована только по одной цепи (сразу после репликации). Напротив, чужеродная ДНК не метилирована и подвергается гидролизу.

Эндонуклеазы рестрикции вносят разрывы в обе цепи ДНК, расщепляя её на две части. В зависимости от специфичности разрезания ДНК, образуются продукты, имеющие разное строение концов.

Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. Ввиду продольной асимметричности молекулы ДНК, концы её цепей неравнозначны. Они обозначаются 3' и 5' в соответствии с нумерацией атомов в 2-R-дезоксирибофуранозиде.

Могут образовываться липкие концы с 5'-выступающими нуклеотидами (такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции BamHI) и 3'-выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3'-концом (такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции AatII).

Тупые концы образуются, в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичностью – EcoRV).

Метилтрансферазы систем рестрикции-модификации добавляют метильные группы к азотистым основаниям нуклеотидных остатков ДНК. Метилирование может проходить по N5 и N6 позициям в аденине, N4 и С5 – в цитозине. Единственный донор метильных групп для ДНК-метилтрансфераз – S-аденозин-L-метионин. В большинстве случаев, метилируется только вторая цепь полуметилированной ДНК, а полностью неметилированная ДНК расщепляется за счёт эндонуклеазной активности СР-М.

Все СР-М требуют наличия Mg2+ в качестве кофактора. СР-М первого и третьего типа нуждаются в АТФ, а четвёртого – в ГТФ. S-аденозилметионин может служить не только донором метильных групп, но и аллостерическим регулятором.

В настоящее время на основании субъединичной структуры, субстратной специфичности, потребности фермента в кофакторах и характере расщепления ДНК выделяют четыре типа систем рестрикции-модификации.

Тип I. СРМ первого типа образованы пятью субъединицами, которые функционируют как единое целое. Субъединицы обозначаются аббревиатурой Hsd (host specificity determinant) и буквой, соответствующей функции (M – ДНК-метилтрансфераза, R – эндонуклеаза рестрикции, S – распознавание субстрата). СР-М первого типа представляют собой комплекс двух HsdM, двух HsdR и одной HsdS. HsdR расщепляет фосфодиэфирные связи в ДНК и обладает геликазной активностью. HsdM производит метилирование остатков аденина в составе сайтов рестрикции по шестому атому азота (m6A). HsdS обеспечивает распознавание определённых участков ДНК, определяя специфичность СР-М.

Тип II. В системах рестрикции-модификации этого типа метилтрансферазная и нуклеазная активности в большинстве случаев обеспечиваются независимыми белками. Эндонуклеазы разрезают ДНК в строго определённых позициях внутри или около сайта рестрикции, в результате концы ДНК в месте разрыва имеют 3'-гидроксильные группы и 5'-фосфатные. Ввиду данных особенностей, эндонуклеазы этого типа (особенно IIP) широко используются в генетической инженерии. Для функционирования СР-М II не требуется АТФ или другие источники энергии. Активные нуклеазы могут существовать в виде мономера, гомодимера или гомотетрамера (для разных систем).

СР-М типа III включают две субъединицы (Res и Mod), которые объединяются в гетеротетрамер (Res2Mod2) с эндонуклеазной и метилтрансферазной активностями. Res-субъединица обладает хеликазной активностью и требует для функционирования гидролиза АТФ. В отличие от СР-М первого типа, для гидролиза ДНК требуется взаимодействие двух комплексов ферментов. Они распознают два идентичных сайта рестрикции, расположенных в противоположной ориентации. Сайты могут быть не метилированы или метилированы по одной цепи.

Mod-субъединица может функционировать отдельно от Res, выполняя функцию метилтрансферазы (m6A). В то же время нуклеазная активность Res-субъединицы проявляется, только когда она находится в комплексе с Mod.

СР-М типа IV расщепляют только модифицированную ДНК, имеющую в составе метилированные, гидроксиметилированные или гликозил-гидроксиметилированые основания. Для расщепления ДНК требуется гидролиз ГТФ. Эндонуклеазная активность обеспечивается одним полипептидом. Метилтрансферазная активность отсутствует. Нуклеазная активность аллостерически активируется S-аденозилметионином. Сайт рестрикции асимметричный, состоит из двух разнесенных частей. Разрезание ДНК происходит около одного из сайтов.