БХ Экзамен 2021

14.ИММУНОГЛОБУЛИНЫ, ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ, ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИГЕНОМ. МНОГООБРАЗИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИХ УЧАСТКОВ Н- И L-ЦЕПЕЙ. КЛАССЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ, ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ.

Иммуноглобулины – семейство защитных белков, принимающих участие в иммунных реакциях, вырабатываются В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм антигенов. Их часто называют также антителами.

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ

Все иммуноглобулины имеют общий план строения: содержат по две тяжелые (Н) и по две легкие цепи (L). В каждой цепи присутствуют константные участки (С) и вариабельные (V). Антигенсвязывающие участки располагаются в области вариабельных частей. Цепи иммуноглобулинов соединены между собой

дисульфидными связями.

ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИГЕНОМ

Основные функции антител – обнаружение и связывание чужеродных антигенов, находящихся в организме вне его клеток (в крови, лимфе, межклеточной жидкости, в слизистых секретах). Это происходит с помощью специфических антигенсвязывающих участков разных клонов иммуноглобулинов. Облегчается процесс дальнейшего разрушения чужеродных веществ

Специфичность пути разрушения комплекса антиген-антитело зависит от класса антител

МНОГООБРАЗИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИХ УЧАСТКОВ Н- И L-ЦЕПЕЙ

Все иммуноглобулины характеризуются общим планом строения: состоят из четырёх полипептидных цепей: двух идентичных лёгких (L - от англ,light), содержащих около 220 аминокислотных остатков, и двух тяжёлых (Н - от англ. heavy), состоящих из 440 аминокислот каждая. Все 4 цепи соединены друг с другом множеством нековалентных и четырьмя дисульфидными связями. Лёгкие цепи состоят из 2 доменов: вариабельного (VL), находящегося в N-концевой области полипептидной цепи, и константного (CL), расположенного на С-конце. Каждый из доменов состоит из 2 слоев с β-складчатой структурой, где участки полипептидной цепи лежат антипараллельно. β-Слои связаны ковалентно дисульфидной связью примерно в середине домена. Тяжёлые цепи имеют 4 домена: один вариабельный (VH), находящийся на N-конце, и три константных (СН1, СН2, СH3). Домены тяжёлых цепей IgG имеют гомологичное строение с доменами лёгких цепей. Между двумя константными доменами тяжёлых цепей СH1, и СН2 есть участок, содержащий большое количество остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Этот участок называют "шарнирной областью"; он придаёт молекуле гибкость. Между вариабельными доменами тяжёлых и лёгких цепей находятся два идентичных участка, связывающих два одинаковых специфических антигена; поэтому такие антитела часто называют "биваленты".

КЛАССЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Иммуноглобулины М - первый класс антител, синтезирующийся в развивающихся В-лимфоцитах. Различают 2 формы иммуноглобулинов М: мономерная, мембранно-связанная форма и пентамерная, секретируемая В- лимфоцитами в кровь.

В тяжёлых цепях их мономеров отсутствует гидрофобная "хвостовая" часть. Пентамерная молекула содержит 10 участков связывания с антигеном, что облегчает вероятность прикрепления Неизвестного ранее антигена к иммуноглобулину . Взаимодействие антигена с IgM изменяет его конформацию и индуцирует связывание его "хвостовой" области с первым компонентом системы комплемента. Если антиген расположен на поверхности микроорганизма, активирование системы комплемента вызывает нарушение целостности клеточной мембраны и гибель бактериальной клетки.

Иммуноглобулины G.

Составляют около 75% от общего количества этих белков.

В крови igg обнаруживают только в мономерной форме; он секретируется активированными в- лимфоцитами в больших количествах при вторичном иммунном ответе, когда антиген повторно попадает в организм.

Эффективно связывают и инактивируют чужеродные молекулы и клетки, попавшие в организм, а также облегчают их дальнейшее уничтожение.

Конформационные изменения в "хвостовой" области igg после его взаимодействия с антигеном приводят к связыванию и активации белков системы комплемента.

С-концевая область igg способна взаимодействовать со специфическими рецепторами макрофагов и нейтрофилов, что приводит к фагоцитозу комплексов антиген-антитело и разрушению их в фагосомах. Igg - единственный класс антител, способный проникать через плацентарный барьер и обеспечивать внутриутробную защиту плода от инфекций.

Иммуноглобулины А.

Основной класс антител, присутствующий в секретах желёз организма (слюны, молока, пищеварительного сока, секретов дыхательных путей).

В сыворотке крови его содержание не превышает 10-15% от общего количества иммуноглобулинов.

Мономерная форма по строению напоминает IgG. Однако в секретах IgA находится в основном в форме димера, где мономеры соединены дополнительной пептидной цепью J

На базальной поверхности эпителиальных клеток димер IgA специфически взаимодействует с белками клеточной поверхности, называемыми секреторным компонентом. Образующийся комплекс посредством эндоцитоза поглощается внутрь клетки и перемещается к апикальной части. Здесь комплекс подвергается действию протеолитических ферментов, и свободный димер высвобождается во внеклеточное пространство. Образующийся при взаимодействии IgA с антигеном комплекс не взаимодействует с белками системы комплемента и фагоцитирующими клетками, но препятствует прикреплению антигенов к поверхности эпителиальных клеток и проникновению их в организм.

Иммуноглобулины Е

Содержание этого класса иммуноглобулинов в крови крайне мало.

IgE - мономеры, но, в отличие от IgG, их тяжёлые цепи е содержат не 3, а 4 константных домена.

После синтеза и секреции в кровь В-лимфоцитами IgE связываются своими С-концевыми участками с соответствующими рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов. В результате они становятся рецепторами антигенов на поверхности данных клеток. После присоединения антигена хотя бы к двум антигенсвязывающим участкам двух соседних IgE клетка получает сигнал к секреции биологически активных веществ (серотонина, гистамина), хранящихся в секреторных пузырьках. Выброс этих веществ в значительной мере ответственен за развитие воспалительной реакции, а также таких аллергических реакций, как бронхиальная астма, крапивница, сенная лихорадка.

Увеличение количества IgE может предшествовать развитию аллергических реакций.

Иммуноглобулины D

IgD обнаружены в крови в очень малых количествах. Мономерные белки играют роль рецепторов В- лимфоцитов; других функций у IgD пока не выявлено.

15.ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ВЕС, РАЗМЕРЫ И ФОРМА, ГИДРАТАЦИЯ, РАСТВОРИМОСТЬ, ИОНИЗАЦИЯ.

Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ:

-высокая молекулярная масса;

-гидратация;

-растворимость;

-образуют коллоидные растворы;

-высокая вязкость растворов;

-растворы обладают оптическими свойствами (преломляют, рассеивают свет и т.д.);

-ионизация.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА от 10000 Да до нескольких миллионов Да (дальтон). Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

РАЗМЕРЫ: 1-100 нм

ФОРМА

глобулярные (шарообразные);

фибриллярные (нитевидные).

РАСТВОРИМОСТЬ: зависит от формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка (все это определяется аминокислотным составом). Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ.

К нерастворимым, или склеропротеинам, относятся, например, кератин (белок, из которого состоят волосы, шерсть млекопитающих, перья птиц и т. п.) и фиброин, который входит в состав шёлка и паутины. Водорастворимые белки называются альбуминами, к ним относятся белки крови и молока.

ГИДРАТАЦИЯ – способность белков связывать молекулы воды за счет наличия в них гидрофильных групп. При гидратации вокруг белков образуется гидратная оболочка, которая препятствует агрегации и осаждению, а, следовательно, способствует устойчивости раствора белка. Примеры гидрофильных групп: -СООН, -NH2, -SH, -ОН, пептидная связь, карбонильная группа.

ИОНИЗАЦИЯ: заряд белковой молекулы обусловлен реакцией среды и соотношением ионогенных групп в белковой молекуле. Влияние АК и среды на заряд белковой молекулы.

Если в белковой молекуле преобладают кислые аминокислоты (аспарагиновая и глутаминовая кислоты), то суммарный заряд белковой молекулы будет отрицательным (в нейтральной среде).

Если в белковой молекуле преобладают основные аминокислоты (лизин, аргинин, гистидин), то суммарный заряд белковой молекулы будет положительным (в нейтральной среде).

Суммарный заряд белковой молекулы зависит от рН среды (в кислой среде заряд положительный, а в щелочной – отрицательный).

Изоэлектрическое состояние (ИЭС) – состояние белка, при котором его суммарный заряд равен нулю.

Изоэлектрическая точка (ИЭТ) – это значение рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии (обозначается рI). Значение рI зависит от аминокислотного состава белка.

16.УСТОЙЧИВОСТЬ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ В РАСТВОРЕ, ФАКТОРЫ ЕЕ ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ

1) ГИДРАТНАЯ ОБОЛОЧКА - это слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами (смотрите рисунок).

Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это - “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства.

Свойства воды гидратной оболочки а) Температура кипения выше 1000С.

б) Температура замерзания ниже 0ОС.

в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.

г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.

2) ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть свободные заряженные СОО- и NH3+ группы. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) большинства белков организма находится в слабокислой среде. Это означает, что у таких белков количество кислотных (СООН) групп больше количества основных групп (NH3). рН плазмы крови около 7,36 - это выше ИЭТ большинства белков, поэтому в плазме крови белки имеют отрицательный заряд. молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

Если каким-то воздействием убрать один или оба стабилизирующие факторы, то белки выпадают в осадок (происходит осаждение белков).

17.МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ: ОСАЖДЕНИЕ СОЛЯМИ И ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ, ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ, ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, ИОНООБМЕННАЯ И АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

I.Высаливание – это обратимое осаждение белков из растворов с помощью высоких концентраций нейтральных солей: сульфата аммония, сульфата магния, хлорида натрия.

Механизм высаливания заключается в дегидратации белковой молекулы и снятии заряда. На процесс высаливания влияют: степень гидрофильности белка, его заряд, молекулярная масса. Поэтому для высаливания разных белков требуется различная концентрация одних и тех же солей, разные условия рН среды.

Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализебелков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

II.Осаждение белков солями тяжелых металлов (сульфатом меди, ацетатом свинца).

Вотличие от высаливания осаждение солями тяжелых металлов:

-является процессом необратимым, механизм которого сводится к нарушению конформации белковой молекулы;

-происходит при низких концентрациях соли;

-при внесении в реакционную смесь большого избытка осадителя происходит процесс адсорбционной пептизации, что сопровождается растворением осадка.

Способность белков давать нерастворимые осадки с солями тяжелых металлов широко используется в клинической практике. При отравлении солями тяжелых металлов (ртути, свинца, меди) в качестве противоядия вводят белки (молоко, раствор яичного белка), которые прочно связывают соль тяжелого металла

вжелудке и прекращают всасывание яда вкровь.

III.Осаждение белков концентрированными минеральным кислотами (концентрированной азотной, серной).

Механизм осаждения обусловлен нарушением конформации белковой молекулы. Происходит денатурация белка, он теряет гидрофильные, приобретает гидрофобные свойства и выпадает в осадок.

В избытке концентрированной кислоты осадок растворяется за счет адсорбционной пептизации. Исключение составляет концентрированная азотная кислота, в избытке которой осадок не растворяется.

IV. Осаждение белков органическими кислотами (трихлоруксусной кислотой, сульфосалициловой

кислотой).

Осаждение органическими кислотами является необратимым процессом. Механизм осаждения заключается в нарушении конформации белковой молекулы, потере гидрофильности и нативных свойств.

Особенностью реакции осаждения трихлоруксусной кислотой является ее способность осаждать белок и не осаждать продукты гидролиза белка. Реакция широко используется в лабораторной практике для получения безбелковых фильтратов крови.

Особенностью реакции осаждения сульфосалициловой кислотой является высокая чувствительность.

Реакция применяется в клинике для обнаружения малых количеств белка в биологических жидкостях (спинномозговой, моче, экссудатах).

V.Гель-фильтрация – фракционирование смеси белков, пептидов по размерам молекул путем их прохождения через гели с определенной величиной пор.

Раствор, содержащий смесь веществ, отличающихся по размеру молекул, вносят в колонку, заполненную гелем с сетчатой структурой и уравновешенную буферным раствором. В качестве неподвижной фазы используют высоко профильные декстраны с поперечными

«сшивками» (сефадексы) или полиакриламидные гели (биогели). Они хорошо набухают в воде и после набухания действуют подобно молекулярному ситу.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

VI. Электрофорез – это движение заряженных частиц в растворе под действием электрического поля.

Принцип метода основан на способности белков под действием внешнего электрического поля передвигаться в растворе к противоположным заряженным полюсам. Скорость и направление движения зависят от знака, величины заряда и относительной молекулярной массы белковой частицы. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки – к катоду (–).

Скорость движения частицы в электрическом поле прямо пропорциональна величине заряда частицы и обратно пропорциональна ее размеру и степени гидратации.

Разделять белки сыворотки крови можно с использованием различных твердых носителей: бумаги, природных и синтетических гелей.

Клинико-диагностическое значение метода: при ряде патологических состояний имеет место количественное изменение белковых фракций сыворотки крови. Нарушение соотношения белковых фракций получило название диспротеинемии. Они встречаются при многих заболеваниях, характеризуются большой динамикой, зависят от фазыпатологического процесса, его длительности и интенсивности лечебных мероприятий. Наиболее выражены диспротеинемии при поражении органов и систем, где идет интенсивный биосинтез белка.

VII. Ионообменная хроматография – метод разделения, анализа и физико-химического исследования веществ, основой которого является эквивалентный обмен ионов раствора на ионы твердой фазы (ионообменная смола – ионообменник). Заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником, так что молекулы могут связываться и элюироваться в зависимости от рН и ионного состава среды.

Применение: в качестве первого этапа очистки белков, для разделения катионов металлов и т.д.

VIII. Аффинная хроматография – метод выделения вещества или группы веществ с использованием их сродства к какому-либо лиганду (для ферментов – субстрат, для антител – антигены и т.д), и это сродство отражает биологические функции исследуемого вещества.

При аффинной хроматографии выделение пептидов и белков осуществляется в результате специфического и обратимого связывания с сорбентом. Благодаря этому пептиды и белки можно концентрировать из большого объема, а также многократно использовать хроматографическую колонку. Обычно при аффинной хроматографии используют иммуносорбенты.

В современной препаративной биохимии аффинная хроматография успешно используется для разделения гомологичных белков, например изоферментов. С помощью данного метода, например, были выделены изоферменты карбоангидразы.

18.МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗМЕРЕНИЯ БЕЛКОВ. ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ОРГАНОВ. ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ОРГАНОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ БОЛЕЗНЯХ.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗМЕРЕНИЯ БЕЛКОВ Прямые (основаны на цветных реакциях или физико-химических свойствах белка):

1.Гравиметрические (основаны на точном измерении массы вещества);

2.Колориметрические (основаны на цветных реакциях белков):

биуретовый метод (основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка);

метод Лоури (основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот и цистеина с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи);

метод Брэдфорда (основан на связывании с белками красителя кумасси синего, спектр поглощения которого при этом не меняется).

3.Оптические (основаны на оптических свойствах белков):

спектрофотометрические (оценивают интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ – поглощения пропорциональна концентрации белка);

рефрактометрические (основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации);

нефелометрические (основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации);

поляриметрические (основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации).

Непрямые (определяют содержание азота в пробе с последующим расчетом количества белка). Определение основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%.

ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ОРГАНОВ

Белковый состав организма здорового взрослого человека относительно постоянен, хотя возможны изменения количества отдельных белков в органах и тканях в зависимости от состава пищи и режима питания, от физиологической активности человека, биологических ритмов. В процессе развития многоклеточного организма, особенно на стадиях дифференцировки клеток, белковый состав значительно изменяется. Для каждого типа специализированных клеток характерно появление специфических белков, которые определяют особенности их биологических функций. Так, только в эритроцитах есть гемоглобин, осуществляющий транспорт кислорода, к тканям, а в клетках сетчатки глаза - белок родопсин, необходимый для улавливания фотонов света. Кроме того, специализированные клетки отличаются и количеством белков, присутствующих практически во всех или во многих клетках организма.Белковый состав различных органов складывается на стадии дифференцировки клеток многоклеточных организмов. Каждый тип специализированных клеток характеризуется определенным набором белков.

Скелетные мышцы - актин и миозин;

В соединительной, хрящевой и костной тканях преобладает межклеточный матрикс, который содержит коллагены (19 различных типов, в зависимости от ткани или органа, что составляет 25-33% от общего количества белка), а также адгезивные белки и протеогликаны.

Печень содержит множество специфических ферментов, обеспечивающих выполнение её метаболических, депонирующих, барьерных, экскреторных и гомеостатических функций. Ферритин, депонирующий железо в клетках, содержится почти во всех тканях, но преимущественно в печени, селезенке и костном мозге.

Кровь также содержит белки-переносчики гормонов, которых нет во внутренних органах.

ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ОРГАНОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ БОЛЕЗНЯХ

В процессе развития многоклеточного организма, особенно на стадиях дифференцировки клеток, белковый состав значительно изменяется. Для каждого типа специализированных клеток характерно появление специфических белков, которые определяют особенности их биологических функций. Так, только в эритроцитах есть гемоглобин, осуществляющий транспорт кислорода, к тканям, а в клетках сетчатки глаза - белок родопсин, необходимый для улавливания фотонов света. Примеризменение в составе гемоглобина

При различных заболеваниях происходит изменение белкового состава тканей. Эти изменения называются протеинопатиями. Различают наследственные и приобретённые протеинопатии.

Наследственные протеинопатии развиваются в результате повреждений в генетическом аппарате данного индивидуума. Какой-либо белок не синтезируется вовсе или синтезируется, но его первичная структура изменена. В зависимости от роли дефектного белка в жизнедеятельности организма, от степени нарушения конформации и функции белков, от гомоили гетерозиготности индивидуума по этому белку наследственные протеинопатии могут вызывать болезни, протекающие с различной степенью тяжести, вплоть до летального исхода ещё до рождения или в первые месяцы после рождения.

Приобретённая протеинопатия Любая болезнь сопровождается изменением белкового состава организма. При этом первичная структура белков не нарушается, а обычно происходит количественное изменение белков, особенно в тех органах и тканях, в которых развивается патологический процесс. В некоторых случаях приобретённые протеинопатии развиваются в результате изменения условий, в которых функционируют белки.

19.ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ. СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ КАК КАТАЛИЗАТОРОВ.

Ферменты (латин. fermentum – «бродило», «закваска»)- энзимы (Е) (греч. en – в, внутри, zyme – дрожжи, т.е. «в дрожжах») – специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и обеспечивающие биокатализ (изменение скорости химических реакций)

ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ещѐ в начале XIX века было известномясо переваривается желудочным соком, а слюна превращает крахмал в сахар. Однако механизм этих явлений был неизвестен. История биохимии –в значительной степени история ферментов.

XVIIIв- Р. Реомюр (француз) - механизм переваривания пищи в желудке хищных птиц.

1814 г. - К.С. Киргофф - проросший ячмень способен превращать полисахарид крахмал в дисахарид мальтозу, а экстракт дрожжей расщепляет свекловичный сахар на моносахариды – глюкозу и фруктозу.

1836-Т. Шванн (немец) открыл в желудочном соке фермент пепсин (греч. pepto – «варю»)

1897-Э. Бухнеру - ферменты, полученные в виде экстракта из живых клеток, катализируют спиртовое брожение (основные метаболические процессы, связанные с производством энергии, могут функционировать вне клетки)

Дж. Самнерпервый фермент в чистом кристаллическом видеуреаза (разрушающий мочевину)

1936- Д. Нортроп получил кристаллы пепсина, трипсина и химотрипсина

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Как белков

Высокая молекулярная масса

Образуют коллоидные растворы

Имеют сложную структурную организацию (первичную, вторичную, третичную и, нек, четвертичную)

Состоят из остатков аминокислот, соединѐнных пептидными связями

Не способны к диализу через полупроницаемые мембраны

Чувствительны к действию температуры

Термолабильны

Обладают высокой вязкостью, оптическими свойствами

Могут обратимо и необратимо осаждаться

Как катализаторов

Катализируют только термодинамически возможные реакции

Не потребляются в ходе реакции и не входят в состав конечных продуктов

В случае обратимости реакции ускоряют и прямую и обратную реакции

Ведут реакцию «в обход энергетического барьера»

Чувствительны к изменению параметров проведения реакции (температуре, рН, С катализатора и реагир. в-в)

Чувствительны к действию эффекторов – активаторов и ингибиторов

Собственные свойства

Высокая биологическая активность

Ферментная специфичность -действия -субстратная

Наличие механизмов регуляции активности

-обладают высокой каталитической активностью по сравнению с минеральными катализаторами

Пример: реакцию разложения пероксида водорода платиновая чернь ускоряет в 2×104 раза, снижая энергию активации с 18 до 12 ккал/моль, а в присутствии каталазы - возрастает в 2×1011 раза с энергией активации 2 ккал/моль. Высокая биологическая активность определяется белковой природой и строением активного центра

20.ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ. ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ, РН, КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА И СУБСТРАТА.

ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

В основе каталитического действия - способность высокоизбирательно образовывать белково-лигандные комплексы с субстратами (веществами, на которые направлено их действие) и вызывать химические превращения субстратов.

Катализ (греч.κατάλσσις – «разрушение») – изменение скорости химической реакции в присутствии катализаторов

Теории катализа:

1)Гетерогенный катализ: реагирующие вещества и катализатор находятся в разных агрегатных состояниях, и химическая реакция ускоряется за счѐт повышения концентрации реагирующих соединений на поверхности раздела фаз

2)Гомогенный катализ: действие катализатора связано с тем, что он всту-пает во взаимодействие с реагирующими веществами с образованием промежуточных соединений, это приводит к снижению энергии акти-вации.

Теория ферментативного катализа включает в себя элементы гомогенного и гетерогенного катализов 1)Фермент адсорбирует в активном центре субстрат и образует с ним нестойкое промежуточное соединение (фермент-субстратный комплекс)

путей превращения.

Так, один и тот же субстрат может вступать в различные химические реакции, каждая из которых катализируется собственным ферментом, например, для

аминокислот характерны реакции декар-боксилирования (фермент декарбоксилаза), дезаминирования (фермент оксидаза аминокислот) и трансаминирования (фермент трансаминаза):

Субстратная специфичность − это способность фермента узнавать, связывать и катализировать превращение только определѐнных субстратов, может быть:

• абсолютная;

• относительная;

• стереоспецифичность.

Абсолютная специфичность: фермент может взаимодействовать только с одним-единственным субстратом. Например, уреаза расщепляет только мочевину, а каталаза – только перекись водорода:

Относительная (групповая) специфичность – фермент может взаимодействовать с группой сходных по строению субстратов. Например, липаза расщепляет сложноэфирные связи в любых жирах (триацилглицеролах), а протеиназы – белки и пептиды, т.е. действуют на пептидные связи.

Стереоспецифичность - фермент действует только на один из возможных изомеров вещества (на D- илиL-стереоизмеры, цисили трансизомеры и т.д.). Так, фермент фумараза гидратирует транс-изомер бутен- 1,4-диовой кислоты (фумаровую кислоту), но не оказывает влияния на цисизомер – малеиновую

ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОТ

от Температуры

Повышение температуры свыше 45-50˚С →тепловая денатурация→инактивпция (исключение – миокиназа мышц, папаин).

С повышением температуры ускоряется движение молекул→повышение вероятности взаимодействия реагирующих в-в. -температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции -скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет

свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением активности, возникающим из-за термической денатурации белковой мол-лы.

Понижение температуры не разрушает, а приостанавливает действие фермента

Холодовая инактивация ферментов обратима, термическая – нет, т.к. она связана с разрушением нативной структуры белка-фермента

Согласно правилу Вант-Гоффа при повышении температуры на каждые 10 градусов скорость химической реакции увеличивается приблизительно в 2-4 раза. Это правило выполняется и для ферментов, но только в пределах до 40-42ºС, затем скорость реакции начинает снижаться, что связано с денату-рацией белка.

Температурный оптимум (скорость реакции максимальна)= 37-38-40˚С(искл: термостабильные ферменты: Taqполимераза, выделенная из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, не инактивируется при повышении температуры до 95 °С. -используют в научно-практической

медицине для молекулярной диагностики заболеваний с использованием (ПЦР)

от Концентрации фермента

При увеличении - скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.

В целом скорость реакции зависит от скорости образования фермент-субстратного комплекса и скорости его разрушения или превращения в фермент-продуктный.

Каждая из этих реакций характеризуется своей константой скорости (k). Для упрощения уравнения была введена объединѐнная константа Михаэлиса, которая учитывает все три константы:

Зависимость скорости от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса-Метнен:

от Концентрации Субстрата

При увеличении скорость реакции сначала возрастает (т.к. к катализу добавляемых молекул субстрата подключаются новые и новые молекулы фермента)→ скорость накопления продукта возрастает→ увеличение активности фермента. Затем→ скорость перестаѐт увеличиваться (плато на кривой), (все молекулы фермента заняты молекулами субстрата и непрерывно ведут катализ)-здесь скорость реакции максимальна, т.е. наступает насыщение фермента

1.на начальных этапах концентрация субстрата значительно меньше Km ([S] << Km). В этом случае знаменатель уравнения мало изменяется при из-менении [S], а величина скорости реакции V прямо пропорциональна [S] (график линеен).

2.когда концентрация субстрата значительно больше Km ([S] >> Km), величиной Km можно пренебречь и при решении получим, что скорость реакции максимальна (плато на графике).

3.если концентрация субстрата равна величине константы Михаэлиса ([S] = Km), по уравнению Михаэлиса-Ментен получаем, что

скорость реакции V будет равна половине максимальной Vmax (V = ½ Vmax). Таким образом, Km соответствует концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

от Реакции среды

Оптимум рН среды -значение рН среды, при котором фермент проявляет максимальную активность для действия данного фермента.

-лежит в пределах физиологических значений 6,0-8,0. (исключения: пепсин, (2,0); аргиназа – (10,0)

Зависимость скорости реакции от концентрации водородных ионов определяется двумя факторами:

1.ионы Н+ и ОН− влияют на степень диссоциации ионогенных групп, т.е. на конформацию белка;

2.ионы Н+ и ОН− влияют на сродство фермента и субстрата, т.к. могут вызывать и изменения конформации субстрата.

При небольшом сдвиге кислотности среды от оптимума скорость реак-ции уменьшается обратимо, при значительном – может насупить кислотная (или щелочная) денатурация, и фермент инактивируется необратимо.