29. Полуконсервативный способ репликации.

Ответ. В исходной молекуле ДНК две цепи расходятся вследствие разрыва водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из цепей – это матрица для образования новой цепи ДНК. Возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют две цепи: старую и новую. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, которая состоит из старой и новой цепи. Полуконсервативный способ репликации был доказан Дж. Тейлором в 1958 г. на митотических клетках корешков бобов. Семена бобов проращивались на среде, содержащей тимидин, в составе которого присутствовал радиоактивный водород ³Н. Радиоактивная метка включалась в ДНК и обнаруживалась в хромосомах делящихся клеток с помощью радиоаутографии. В нормальной среде после одного деления клеток метку обнаруживали в обеих хроматидах метафазных хромосом, однако ее количество было меньшим наполовину, так как метка оставалась только в материнской нити ДНК, а вновь синтезированная нить была уже без метки. После второго деления одна хроматида содержала метку, а в другой она отсутствовала. Результаты опыта позволяют предположить, что хроматида состоит из одной молекулы ДНК и ДНК реплицируется полуконсервативно. Доказательство полуконсервативного характера было представлено М. Мезельсоном и Ф. Сталем в 1958 г. В эксперименте работа велась с ДНК меченными 15N и 14N. В первом случае плотность ДНК составляет 1,724, а во втором – 14N г/см³. С целью их разделения ученые применили центрифугирование в градиенте плотности, устанавливаемом при высокой скорости в течение 50-60 часов водного раствора хлористого цезия 6М концентрации. В таком градиенте плотности хлористого цезия ДНК, когда она достигает седиментационного равновесия, образует полосу на уровне той плотности градиента, которая соответствует ее собственной. Бактерии Е. coli выращивали на протяжении 14 поколений на среде, содержащей радиоактивный азот (15N), для того, чтобы вся ДНК включила 15N и стала «тяжелой». Затем клетки синхронизировали и пересадили в среду с изотопом азота 14N, чтобы вновь синтезированные цепи ДНК стали «легкими». Из клеток, выращиваемых на среде с легким (14N) начиная с первой генерации, выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте плотности CsCI.

30. Ферменты репликации. Репликационная вилка. Репликационный глазок.

Ответ. В репликации участвуют следующие ферменты.Хеликазы. Белки инициации репликации DnaA, DnaB, DnaC. SSB-белки. ДНК-праймаза (РНК-полимераза). ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза Ι; ДНК-полимераза ΙΙ; ДНК-полимераза ΙΙΙ. ДНК-лигаза. ДНК-топоизомеразы – изменяют степень сверхспирализации ДНК путем внесения одноцепочечных или двухцепочечных разрывов в ДНК; ДНК-хеликаза – разделяет двухцепочечную ДНК на одинарные цепи; ДНК-полимеразы – катализируют синтез дочерних цепей на матрице ДНК по принципу комплементарности; ДНК-лигаза – сшивает одноцепочечные фрагменты ДНК. Хеликазы – это ферменты, которые способны расплетать две комплементарные нити ДНК с использованием энергии, полученной при гидролизе АТФ. У бактерий имеется две хеликазы – хеликаза Rep и хеликаза DnaB. Хеликаза Rep продвигается от 3’-конца к 5’-концу цепи ДНК, служащей матрицей для ведущей цепи ДНК. Хеликаза DnaB продвигается по противоположной цепи, служащей для синтеза запаздывающей цепи. Роль ssb-белков заключается в том, что они связываются с однонитчатой ДНК, выпрямляют ее и блокируют образование шпилечных двухнитчатых структур. SSB-белки обнаружены в 1968 г. Они снижают температуру плавления ДНК in vitro на 20-40◦С и связываются с ДНК электростатически. У ssb-белков повышенное сродство к одноцепочечной ДНК, с которой они связываются, не закрывая азотистые основания. Они крепятся по всей длине разделившихся цепей и предотвращают их комплементарное скручивание, образование «шпилек». Белки не связываются с двуцепочечной ДНК, не имеющей расплавленных участков. Репликационная вилка – Y-образная структура, перемещающаяся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся расхождением двух ее цепей, в пределах которой происходит активная репликация ДНК. Репликация молекул ДНК у прокариот протекает несколько иначе, чем у эукариот. У прокариот одна из нитей ДНК разрывается, и один конец ее прикрепляется к клеточной мембране, а на противоположном конце происходит синтез дочерних нитей. Такой синтез дочерних нитей ДНК получил название «катящегося обруча». У бактерий скорость репликации составляет 30 мкм в минуту. За минуту к нитке-матрице присоединяется около 500 нуклеотидов, у вирусов – порядка 900. У эукариот процесс репликации несколько медленнее. У них дочерняя нить удлиняется на 1,5-2,5 мкм в минуту. ДНК всех живых существ устроена одинаково, но различается коэффициентом видоспецифичности, который представляет собой отношение молекулярной суммы А+Т к молекулярной сумме Г+Ц. Видоспецифичность ДНК выражается процентом или долей в ней ГЦ-пар. ДНК-полимеразы эукариот: для репликации ядерной ДНК: полимеразы α, ϭ ,ϵ; для репликации митохондриальной ДНК: полимераза γ. Для репарации ДНК: полимеразы β, ϵ, κ, μ, η. Способы репликации различных геномов. Репликация по типу глазка или θ – структуры (для кольцевых геномов). Репликация по типу множественных глазков при репликации хромосом эукариотических организмов. Репликация по типу крутящегося кольца (для хромосомы Е.coli во время коньюгации, а также для геномов бактериофагов и многих вирусов). Репликация по типу D-петли (репликация хлоропластов и митохондрий). Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп можно наблюдать репликационный глазок — участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окружённый более протяжёнными участками нереплицированной ДНК.