23. Конъюгация бактерий.

Ответ. Конъюгацией называется непосредственный контакт между клетками бактерий, сопровождаемый переносом генетического материала из клеток донора в клетки реципиента. Процесс конъюгации у бактерий E. coli был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Е. Тэйтумом. В ходе исследований ученые руководствовались следующими принципами, ставшими затем классическими при обнаружении полового процесса у любых микроорганизмов: необходимо работать со штаммами одного вида бактерий; следует учитывать различия по нескольким стабильным признакам; для получения гибридов или рекомбинантов необходимо применять метод селективных сред, позволяющих регистрировать даже очень редкие события. В отношении первых двух положений эта методология восходит к правилам менделевского гибридологического анализа. В соответствии с изложенными принципами Дж. Ледерберг и Е. Тэйтум взяли два штамма Е. coli, маркированные несколькими мутациями ауксотрофности. Первый штамм нуждался в треонине, лейцине и тиамине, а второй – в биотине и метионине. Реверсию, т.е. восстановление прототрофности по отдельным признакам, наблюдали с частотой около 1х10^-7. Следовательно, выбранные штаммы могли бы ревертировать к дикому типу, т.е. к полной прототрофности с частотой 1-10^-14-1 × 10^-21, если реверсии по всем признакам происходят независимо друг от друга. Эти штаммы смешали в жидкой полноценной среде и инкубировали в течение 24 ч. После этого смесь высеяли на минимальную среду, не содержавшую тех соединений, в которых нуждались исследуемые бактерии. Около 100 клеток на каждые 109 высеянных образовали колонии, т.е. прототрофы появились с частотой 1-10^-7, что значительно превосходит (на 7-14 порядков) частоту спонтанного ревертирования. Следовательно, эффект обусловлен именно совместным инкубированием двух штаммов и представляет собой какой-то вариант полового процесса. Маркеры донора передаются реципиенту в определенной последовательности с убывающей вероятностью. Это указывает на ориентированный перенос генетического материала.Ф. Жакоб и Е. Вольман в 1961 г. провели эксперименты по прерыванию конъюгации у Е. coli. Они смешивали клетки F- и Hfr при 37°С в жидкой среде. Через равные интервалы времени они отбирали пробы и встряхивали их в гомогенизаторе при 4°С, тем самым прерывая конъюгацию. Затем высевали на среду для учета рекомбинантов по различным маркерам. Первые 8 мин. рекомбинантов вообще не было, а затем они стали появляться в характерные для каждого типа рекомбинантов временные интервалы. С тех пор этот метод получил широкое распространение. Расстояния на генетической карте Е. coli измеряются в минутах. Взаимоотношения F-эписомы и бактериальной хромосомы можно представить следующим образом. В клетках F отсутствует F-фактор. Клетки F+, в результате потери F-фактора становятся клетками F-. Перенос F-фактора в клетки F- превращает их в клетки F+. Возможна интеграция F-фактора с бактериальной хромосомой, и тогда при конъюгации она переносится в F-реципиенты. У штаммов Hfr F-фактор интегрирован с хромосомой, F-фактор – представитель более широкого класса конъюгативных плазмид, обнаруженных у разных бактерий, способных мобилизовать хромосому при конъюгации и передавать ее реципиентам. Присутствие F-фактора определяет образование на клетках Е. coli половых ворсинок, или пилей, выполняющих активные функции при конъюгации. Они есть у F+ и у Hfr, но не у клеток F-. Именно на этих половых ворсинках адсорбируются бактериофаги, специфичные к мужским клеткам, или мужские бактериофаги. Это РНК-содержащие фаги: R17, MS2, Qβ, f2, а также фаги с одноцепочечной ДНК: fd, fl, М13. Половые пили, по-видимому, необходимы для удержания конъюгирующих бактерий. Обычно автономный F-фактор при размножении бактерий реплицируется, подобно бактериальной хромосоме, образуя θ-образные фигуры в качестве промежуточного продукта репликации. Установление конъюгационного контакта между клетками, возможно, служит сигналом для активации или синтеза ферментов, участвующих в переносе ДНК, в частности ферментов, разрывающих одну нить в ДНК F-фактора. Однонитевой разрыв отмечается в точке, отличной от обычной точки инициации репликации F-фактора. Если скрещиваются F+ и F, то освобождаемый в результате надреза в конец цепи ДНК начинает «разматываться» и проникает в клетку F-. Таким образом, в донор попадает одноцепочечная копия F-фактора, которая там реплицируется и превращается в двуцепочечную форму, замыкающуюся в кольцо. То, что в F--клетки передается только одна цепь F-фактора, показано с помощью так называемых мини-клеток Е. coli. У этой бактерии есть F-штаммы, в значительном количестве образующие абортивные клетки размером около 10% от нормальных и лишенные нуклеоида. Это и есть мини-клетки. Они не способны реплицировать ДНК. После конъюгации с клетками F+ из мини-клеток были выделены одноцепочечные копии F-ДНК. Если F-фактор интегрирован с хромосомой, то при конъюгации надрез F-фактора инициирует ее репликацию по механизму катящегося кольца и передачу однонитевой копии хромосомы в клетку-реципиент. Это также было продемонстрировано с помощью мини-клеток. Таким образом, при конъюгации часть F-фактора передается вместе с первыми маркерами, а часть – с самыми последними, что бывает очень редко из-за разрывов конъюгационного канала и переносимой ДНК.