50. Получение рекомбинантных белков с помощью прокариотических систем

Генетическая инженерия – ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности и способы создания лабораторным путем генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм.

Рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК , полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке . Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные вне клетки два компонента: - вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии; - фрагмент клонируемой ДНК, содержащие интересующие исследователя генетические элементы. Наиболее важные методы биотехнологии рекомбинантных ДНК: 1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различиных генов и манипуляции с ними. 2. Быстрое секвенирование(установление последовательности азотистых оснований ДНК) всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида; 3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания. 4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерии. 5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы.

Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. Coli. Достоинства E. Coli.: высокий уровень экспрессии, низкая цена, быстрый рост, индотоксины отсуствуют, простые условия культивирования.

Недостатки E. Coli.: Плохо формируют дисульфидные связи, возможность нарушения формирования белка, неэффективность рефолдинга, отличие кодонов от соответсвующих эукариот, минимальные пострансляционные модификации.

Дрожжи. Их преимущество заключается прежде всего в "технологичности": дрожжи легко выращивать в условиях производства. Они характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания, легко отделяются, не загрязняют воздух спорами. Клетки дрожжей содержат до 25% сухих веществ. Наиболее ценный компонент дрожжевой биомассы - белок, который по составу аминокислот превосходит белок зерна злаковых культур и лишь немного уступает белкам молока и рыбной муки. Биологическая ценность дрожжевого белка определяется наличием значительного количества незаменимых аминокислот. По содержанию витаминов дрожжи превосходят все белковые корма, в том числе и рыбную муку. Кроме того, дрожжевые клетки содержат микроэлементы и значительное количество жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты. При скармливании кормовых дрожжей коровам повышаются удои и содержание жира в молоке, а у пушных зверей улучшается качество меха. Интерес представляют и дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов.