14. Использование клеточных культур в биотехнологических процессах

Хранение:

- Бактерии (лиофилизация, жидкий азот, пересевы, под вазел. маслом, низкая температура, физ. р-ры, высушивание (замораживание ,а потом возгонка) -Дрожжи (лиофилизация, под вазел. маслом, 20% р-р сахарозы) -Грибы (лиофилизация, жидкий азот, температура (-20), дист.вода ,физ р-ры) -Водоросли (лиофилизация, жидкий азот, пересевы) -Простейшие (лиофилизация, субкультуры)

Суспензионные культуры- отдельные типы клеток , выращ. во взвешенном сост. в жидкой среде.

Культуры: 1. Первичные (не предназначенные для длительного хранения, сохр. генотипа и фенотипа (почки, легкие). 2. Перевиваемые ( размнож. вне организма долгое время ) пересевы стабильны. 3. Диплоидные ( линии, в которых 75 % клеток имеют кариотип )использ. для культивирования клеток.

Гибридомная технология:

Гибридомные клетки образ. при слиянии клеток с различными ген. программами ( дифференц. клетки + трансформир. клетки)

Техника культивирования «в пробирке» Первичн. эксплант верхушечн. мерист. травян. растений (гвоздика. хризантема )

Жан Морель – получил первые раст. – регенеранты орхидей Первые работы по культуре тканей древесных растений .

Микроклональное размножение- массовое бесполое размножение раст. В пробирке , при котором полученные особи раст. генетически идентичны исходному экземпляру.

В основе метода – тотипотентность клеток ( способность клеток путем деления дать начало любому типу организма)

Преимущество метода: 1.Получение генетически однородного материала 2. Освобождение раст. от вирусов 3. Размножение с высокой скоростью 4. Процесс селекции сокращ. 5. Размнож. Раст.,трудно разможающ. традицион. способами 6. Возможность провед. Работ в течении всего года , а не только в течении вегетационного периода. 7. Возможность автоматизации процессов выращивания

Модели микроклонального размножения

А) Образование адвентивных побегов тканями экспланта ( побеги ,которые образ. на любом участке стебля, корня или листа ). М-д очень эффективен ,все признаки размнож. Организма полностью сохраняются .

Б) Развитие пазушных побегов основано на снятии апикального доминирования, это наиболее надежный способ, заключающийся в ведении полученной массы побегов на микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения

Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов: - вид и тип клеток, - их концентрация в суспензии, - состав среды для консервирования, - вид и концентрация криопротектора, - режим охлаждения и отогрева, - способ реабилитации клеток после отогрева.

Оптимальный результат по восст. кл. были получены при замораживании клеточных суспензий плотностью 1*105-5*106 клеток в 1 мл.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества: 1. Сорбит для уменьшения размера вакуолей. 2. Искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования.

Охлаждение 1-й этап: от +20 до -28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут. 2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196oC). Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане.

Методы создания клеточных культур растений

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению.

Культивирование клеток растений в жидкой среде- легче влиять на метаболизм и рост клеточных популяций различного рода.

М-ды выращивания изолированных клеток, которые получают выделением их из суспензий с помощью микроманипулятора .

Протопласты растительных клеток

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри.

Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.