Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных
.pdf1.2 Этапы развития вирусологии
История достижений вирусологии напрямую связана с успехами развития ме-
тодической базы исследований.
Конец XIX — начало XX-го века. Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры(свечи
Шамберлана), которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. С использованием фильтруемости через бактериологические фильтры были открыты следующие вирусы:
–1892 г. – вирус табачной мозаики;
–1898 г. – вирус ящура;
–1899 г. – вирус чумы рогатого скота;
–1900 г. – вирус желтой лихорадки;
–1902 г. – вирус оспы птиц и овец;
–1903 г. – вирус бешенства и вирус чумы свиней;
–1904 г. – вирус оспы человека;
–1905 г. – вирус чумы собак и вирус вакцины;
–1907 г. – вирус денге;
–1908 г. – вирус оспы и трахомы;
–1909 г. – вирус полиомиелита;
–1911 г. – вирус саркомы Рауса;
–1915 г. – бактериофаги;
–1916 г. – вирус кори;
–1917 г. – вирус герпеса;
–1926 г. – вирус везикулярного стоматита.
30-е годы – основным вирусологическим методом, используемым для выделе-
ния вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные
(белые мыши – для вирусов гриппа, новорожденные мыши – для вирусов Коксаки,
шимпанзе – для вируса гепатита B, куры, голуби – для онкогенных вирусов, порося-
та-гнотобионты – для кишечных вирусов и т. д.). Первым, кто начал систематически
21
использовать лабораторных животных при изучении вирусов, был Пастер, который еще в 1881 г. проводил исследования по инокуляции материала от больных бешен-
ством в мозг кролика. Другая веха – работы по изучению желтой лихорадки, следст-
вием которых явилось использование в вирусологической практике новорожденных мышей. Кульминацией этого цикла работ стало выделение Сайклзом 1948в г. на мышах-сосунках группы вирусов эпидемической миалгии.
1931 г. – в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза, саркомы кур и некоторым другим вирусам. И в на-
стоящее время куриные эмбрионы широко используются для выделения вирусов гриппа.
1932 г. – английский химик Элфорд создает искусственные мелкопористые коллоидные мембраны — основу для метода ультрафильтрации, с помощью которо-
го стало возможным проводить определение размера вирусных частиц и дифферен-
цировать вирусы по этому признаку.
1935 г. – применение метода центрифугирования дало возможность кристал-
лизации вируса табачной мозаики. В настоящее время методы центрифугирования и ультрацентрифугирования (ускорение на дне пробирки превышает200000 g) широ-
ко используются для выделения и очистки вирусов.
В 1939 г. для изучения вирусов впервые был применен электронный микро-
скоп, обладающий разрешающей способностью от0,2 до 0,3 нм. Использование ультратонких срезов тканей и метода негативного контрастирования водных суспен-
зий позволило проводить изучение взаимодействия вирусов с клеткой и исследовать структуру (архитектуру) вирионов. Сведения, полученные с помощью электронного микроскопа, были значительно расширены с помощью рентгеноструктурного анали-
за кристаллов и псевдокристаллов вирусов. Совершенствование электронных мик-
роскопов завершилось созданием сканирующих микроскопов, позволяющих полу-
чать объемные изображения. С использованием метода электронной микроскопии изучена архитектура вирионов, особенности их проникновения в клетку хозяина.
В этот период была открыта основная масса вирусов. В качестве примера мо-
22
гут быть приведены следующие:
–1931 г. – вирус гриппа свиней и вирус западного энцефаломиелита лошадей;
–1933 г. – вирус гриппа человека и вирус восточного энцефаломиелита лоша-
дей;
–1934 г. – вирус паротита;
–1936г. – вирус рака молочной железы мышей;
–1937г. – вирус клещевого энцефалита.
40-е годы. В 1940 г. Хогланд с коллегами установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК.
1941 г. – американский ученый Херст на модели вируса гриппа открыл фено-
мен гемагглютинации (склеивания эритроцитов). Это открытие легло в основу раз-
работки методов выявления и идентификации вирусов и способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой. Принцип гемагглютинации положен в основу ря-
да методов:
РГА – реакция гемагглютинации – применяется для обнаружения и титрова-
ния вирусов;
РТГА – реакция торможения гемагглютинации – применяется для идентифи-
кации и титрования вирусов.
1942 г. – Херст устанавливает наличие у вируса гриппа фермента, который позднее идентифицирован как нейраминидаза.
1949 г. – открытие возможности культивирования клеток животных тканей в искусственных условиях. В 1952 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелев-
скую премию за разработку метода культуры клеток.
Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием,
давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе ат-
тенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита,
паротита, кори и краснухи.
23
Создателями вакцин против полиомиелита являются американские вирусологи Сэбин (трехвалентная живая вакцина на основе аттенуированных штаммов полио-
вирусов трех серотипов) и Солк (убитая трехвалентная вакцина). В нашей стране советскими вирусологами М.П. Чумаковым и А.А. Смородинцевым разработана технология производства живой и убитой вакцин против полиомиелита. В 1988 г.
Всемирная ассамблея здравоохранения поставила перед ВОЗ задачу ликвидации по-
лиомиелита во всем мире с полным прекращением циркуляции дикого полиовируса.
К настоящему времени достигнут огромный прогресс в этом направлении. Приме-
нение глобальной вакцинации против полиомиелита с применением «туровых» схем вакцинации позволило не только кардинально снизить заболеваемость, но и создать территории, свободные от циркуляции дикого полиовируса.
Открыты вирусы:
–1945 г. – вирус Крымской геморрагической лихорадки;
–1948 г. – вирусы Коксаки.
50-е годы. В 1952 г. Дульбекко разрабатывает метод титрования бляшек в мо-
нослое клеток эмбриона цыпленка, что позволило ввести в вирусологию количест-
венный аспект. 1956-62 гг. Уотсон, Каспар (США) и Клуг (Великобритания) разра-
батывают общую теорию симметрии вирусных частиц. Структура вирусной частицы стала одним из критериев в системе классификации вирусов.
Этот период характеризовался значительными достижениями в области бакте-
риофагов:
– установлена индукция профага лизогенизирующих фагов(Львов и др., 1950 г.);
– доказано, что инфекционность присуща фаговой ДНК, а не белковой обо-
лочке (Херши, Чейз, 1952 г.);
– открыто явление общей трансдукции (Циндер, Ледерберг, 1952 г.).
Реконструирован инфекционный вирус табачной мозаики(Френкель-Конрад,
Вильяме, Сингер, 1955-1957 гг.), в 1955 г. получен в кристаллическом виде вирус полиомиелита (Шаффер, Шверд, 1955 г.).
Открыты вирусы:
24
–1951 г. – вирусы лейкоза мышей и ECHO;
–1953 г. – аденовирусы;
–1954 г. – вирус краснухи;
– 1956 г. – вирусы |
парагриппа, цитомегаловирус, респираторно- |
синцитиальный вирус; |
|
–1957 г. – вирус полиомы;
–1959 г. – вирус аргентинской геморрагической лихорадки.
60-е годы характеризуются расцветом молекулярно-биологических методов исследования. Достижения в области химии, физики, молекулярной биологии и ге-
нетики легли в основу методической базы научных исследований, которые стали применяться не только на уровне методик, но и целых технологий, где вирусы вы-
ступают не только как объект исследований, но и как инструмент. Ни одно открытие молекулярной биологии не обходится без вирусной модели.
1967 г. – Катес и МакАуслан демонстрируют присутствие в вирионе осповак-
цины ДНК-зависимой РНК-полимеразы. В следующем году обнаруживается РНК-
зависимая РНК-полимераза у реовирусов, а затем у парамиксо- и рабдовирусов. В 1968 г. Якобсон и Балтимор устанавливают наличие у полиовирусов геномного бел-
ка, соединенного с РНК, Балтимор и Бостон устанавливают, что геномная РНК по-
лиовируса транслируется в полипротеин.
Открыты вирусы:
–1960 г. – риновирусы;
–1963 г. – австралийский антиген (HBsAg).
70-е годы. Балтимор одновременно с Темином и Мизутани сообщают об -от крытии в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов фермента обратной транс-
криптазы (ревертазы). Становится реальным изучение генома РНК содержащих ви-
русов.
Изучение экспрессии генов у вирусов эукариот дало фундаментальнуюин формацию о молекулярной биологии самих эукариот– существование кэп-
структуры мРНК и ее роль в трансляции РНК, наличие полиадениловой последова-
тельности на 3'-конце мРНК, сплайсинг и роль энхансеров в транскрипции впервые
25
выявлены при изучении вирусов животных.
1972 г. – Берг публикует сообщение о создании рекомбинантной молекулы ДНК. Возникает новый раздел молекулярной биологии – генная инженерия. Приме-
нение технологии рекомбинантных ДНК позволяет получать белки, имеющие важ-
ное значение в медицине (инсулин, интерферон, вакцины). 1975 г. – Келер и Миль-
штейн получают первые линии гибридов, продуцирующих моноклональные антите-
ла (МКА). На основе МКА разрабатываются самые специфичные тест-системы для диагностики вирусных инфекций. 1976 г. – Бламберг за открытие HBsAg получает Нобелевскую премию. Установлено, что гепатит A и гепатит B вызываются разны-
ми вирусами.
Открыты вирусы:
–1970 г. – вирус гепатита B;
–1973 г. – ротавирусы, вирус гепатита A;
–1977 г. – вирус гепатита дельта.
80-е годы. Развитие заложенных отечественным ученым Л.А. Зильбером пред-
ставлений о том, что возникновение опухолей может быть связано с вирусами. Ком-
поненты вирусов, ответственные за развитие опухолей, назвали онкогенами. Вирус-
ные онкогены оказались в числе лучших модельных систем, помогающих изучению механизмов онкогенетической трансформации клеток млекопитающих.
– 1985 г. – Мюллис получает Нобелевскую премию за открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это – молекулярно-генетический метод диагностики, позво-
ливший, кроме того, усовершенствовать технологию получения рекомбинантных ДНК и открыть новые вирусы.
Открыты вирусы:
–1983 г. – вирус иммунодефицита человека;
–1989 г. – вирус гепатита C;
–1995 г. – с использованием ПЦР открыт вирус гепатита G.
26
1.3 Развитие концепции о природе вирусов
Ответы на вопросы «Что такое вирусы?» и «Какова их природа?» составляли предмет дискуссии многие годы со времени их открытия. В 20-30 гг. никто не со-
мневался, что вирусы являются живой материей. В 30-40 гг. считалось, что вирусы – это микроорганизмы, так как способны размножаться, обладают наследственностью,
изменчивостью и приспособляемостью к меняющимся условиям среды обитания, и,
наконец, подвержены биологической эволюции, которая обеспечивается естествен-
ным и искусственным отбором. В 60-е годы первые успехи молекулярной биологии определили закат концепции о вирусах как организмах. В онтогенетическом цикле вируса выделены две формы– внеклеточная и внутриклеточная. Для обозначения внеклеточной формы вируса введен термин ВИРИОН. Установлены отличия его ор-
ганизации от строения клеток. Обобщены факты, указывающие на совершенно от-
личный от клеток тип размножения, названный дисъюнктивная репродукция. Дисъ-
юнктивная репродукция – это временная и территориальная разобщенность синтеза вирусных компонентов – генетического материала и белков – от последующей сбор-
ки и формирования вирионов. Показано, что генетический материал вирусов пред-
ставлен одним из двух типов нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). Сформулирова-
но, что основным и абсолютным критерием отличия вирусов от всех других форм жизни является отсутствие у них собственных белоксинтезирующих систем.
Накопившиеся данные позволили прийти к выводу, что вирусы не являются организмами, пусть даже мельчайшими, так как любые, даже минимальные орга-
низмы типа микоплазм, риккетсий и хламидий имеют собственные белоксинтези-
рующие системы. Согласно определению, сформулированному академиком В.М. Ждановым, вирусы являются автономными генетическими структурами, спо-
собными функционировать только в клетках с разной степенью зависимости от кле-
точных систем синтеза нуклеиновых кислот и полной зависимостью от клеточных белоксинтезирующих и энергетических систем, и подвергающимися самостоятель-
ной эволюции.
С точки зрения паразитологии, вирусы – облигатные внутриклеточные парази27
ты. Паразитизм (от греческого parasitos – нахлебник) – состояние симбиоза, при ко-
тором один организм (паразит) живет за счет другого, нанося ему вред. При этом паразит физически и физиологически зависит от хозяина. Внутриклеточный парази-
тизм – это высшая стадия облигатного паразитизма, суть которого заключается в аб-
солютной зависимости метаболизма паразита от организма хозяина и характеризу-
ется полной невозможностью размножения паразита за пределами клетки. Однако уровень паразитизма вирусов качественно иной, чем у внутриклеточных паразитов-
микроорганизмов. Вирусы – это генетические паразиты. Крайним проявлением ге-
нетического паразитизма является способность ряда вирусов интегрировать в геном клетки хозяина. С этой точки зрения вирусы могут быть определены как особая не-
клеточная форма жизни, которой присущ строгий внутриклеточный паразитизм на молекулярном и молекулярно-генетическом уровнях,
Таким образом, вирусы представляют собой многообразную и многочислен-
ную группу неклеточных форм жизни, не являющихся микроорганизмами, и объе-
диненных в царство Vira, Вирусы изучаются в рамках вирусологии, которая пред-
ставляет собой самостоятельную научную дисциплину, имеющую свой объект и ме-
тоды исследования.
Вирусологию разделяют на общую и частную, а вирусологические исследова-
ния – на фундаментальные и прикладные. Предметом фундаментальных исследова-
ний в вирусологии является архитектура вирионов, их состав, особенности взаимо-
действия вирусов с клеткой, способы переноса наследственной информации, моле-
кулярные механизмы синтеза элементов и процесс их объединения в целое, молеку-
лярные механизмы изменчивости вирусов и их эволюция. Прикладные исследова-
ния в вирусологии связаны с решением проблем медицины, ветеринарии и фитопа-
тологии.
1.4 Происхождение вирусов
По вопросу о происхождении вирусов высказывались разные предположения.
Одни авторы считали, что вирусы являются результатом крайнего проявления рег28
рессивной эволюции бактерий или других одноклеточных организмов. Гипотеза регрессивной эволюции не может объяснить разнообразия генетического материала у вирусов, неклеточной их организации, дисьюнктивного способа репродукции и отсутствия белоксинтезирующих систем. Поэтому в настоящее время эта гипотеза имеет скорее историческое значение в не разделяется большинством вирусологов.
Согласно второй гипотезе вирусы являются потомками древних, доклеточных форм жизни – протобионтов, предшествовавших появлению клеточных форм жиз-
ни, с которых и началась биологическая эволюция. Эта гипотеза также не разделяет-
ся в настоящее время большинством вирусологов, так как она не объясняет тех же вопросов, разрешить которые оказалась бессильной первая гипотеза.
Третья гипотеза предполагает, что вирусы произошли от генетических эле-
ментов клеток, ставших автономными, хотя не ясно, какие из этих элементов дали начало столь большому разнообразию генетического материала у вирусов. Эта ги-
потеза, которую иронически назвали гипотезой «взбесившихся генов», находит наи-
большее число сторонников, однако не в том первоначальном виде, в каком она бы-
ла высказана, так как и она не объясняет наличие у вирусов форм генетического ма-
териала (однонитчатая ДНК, двунитчатая РНК), отсутствующих в клетках, образо-
вание капсида, существование двух форм симметрии и т.п.
Вероятно, вирусы действительно являются дериватами генетических элемен-
тов клеток, но они возникали и эволюционировали вместе с возникновением и эво-
люцией клеточных форм жизни. Природа как бы испробовала на вирусах все воз-
можные формы генетического материала(разные виды РНК и ДНК), прежде чем окончательно остановила свой выбор на канонической его форме– двунитчатой ДНК, общей для всех клеточных форм организмов, начиная от бактерии и кончая человеком. Будучи, с одной стороны, автономными генетическими структурами, с
другой стороны, неспособными развиваться вне клеток, вирусы на протяжении мил-
лиардов лет биологической эволюции проделали настолько разнообразные пути развития, что отдельные их группы не имеют преемственной связи между собой.
По-видимому, разные группы вирусов возникали в исторически разные времена из разных генетических элементов клеток и поэтому существующие в настоящее время
29
разные группы вирусов имеют полифилетическое происхождение, т.е. не имеют единого общего предка. Тем не менее, универсальность генетического кода распро-
страняется и на вирусы, свидетельствуя тем самым, что и они являются порождени-
ем органического мира земли.
2 Химический состав вирусов
Основными химическими соединениями, которые входят в состав всех виру-
сов, являются белки и нуклеиновые кислоты. В состав ряда вирусов входят липиды и углеводы.
Белки. Локализация вирусных белков. Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнару-
жены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета – ак-
тин, и ядерные белки – гистоны. Белки клеточного происхождения, участвующие в процессе репликации вируса, будут рассмотрены в разделе взаимодействия вируса с клеткой.
По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделя-
ют на две группы: 1) структурные белки – это белки, входящие в состав ВЧ, их обозначают как VP; 2) неструктурные белки – это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ. Их обозначают как NS-белки.
Свойства вирусных белков. В состав вирионов входят белки с различной мо-
лекулярной массой (от 4 до 100 кД), состоящие из одной или нескольких полипеп-
тидных цепей. Количество этих белков также различно у разных вирусов. В состав нуклеокапсида ВТМ входит один белок. У других вирусов в состав вириона может входить несколько десятков белков, имеющих различные физико-химические свой-
ства. Белки, формирующие капсид, нуклеокапсид и коровую оболочку, обладают одним общим свойством – способностью к самосборке.
В состав ВЧ могут входить низкомолекулярные белки, не участвующие в
30