Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

При определении гомологии РНК водных и клинических штаммов ВГА путем секвенирования нуклеотидных последовательностей различных штаммов показана их идентичность в пределах от 90,4 % до 92,1 %, что подтверждает водный путь пе-

редачи возбудителя гепатита А.

Метод рестрикционного анализа хромосомной ДНК с использованием рест-

риктазы EcoRI на основе пульс-электрофореза позволяет разделять выделенные штаммы на группы по типу рестриктограммы. Полимеразная цепная реакция – это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий об-

наружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК.

Открытие метода полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее вы-

дающихся событий в области молекулярной биологии за последние годы.

Полимеразная цепная реакция – ПЦР (PCR – polymerase chain reaction)

Принцип метода заключается в естественной репликации ДНК, включающей тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты(плавление), ее отжиг с синтетиче-

скими олигонуклеотидными праймерами и удлинение цепи(элонгация). Смена этих этапов происходит в результате простого изменения температуры реакционной сме-

си. Метод ПЦР обеспечивает многократное приумножение (амплификацию, amplification – усиление, увеличение) в условиях in vitro фрагментов генома и быстрое на-

копление практически в любых количествах определенной, интересующей исследо-

вателя последовательности ДНК, которая первоначально может быть представлена всего лишь одной молекулой. В результате получают количество материала, доста-

точное для проведения анализа обычными методами детекции. Сущность метода ПЦР составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий полимеразную реакцию и денатурацию синтезированного фрагмента двунитевой ДНК и отжиг праймеров, что, в конечном счете, может привести к неограниченному увеличению исходного материала.

Реактивы (компоненты реакционной смеси).

1 Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из нуклеотидов в количестве от 18 до 25, комплиментарных сайтам (участкам) на идентифицируемой

241

матричной ДНК. Синтез праймеров – довольно трудоемкий процесс. В настоящее время подбор последовательности обеспечивается автоматически с использованием соответствующих компьютерных программ. Выбор праймеров является наиболее важным звеном ПЦР, так как именно ими определяется возможность амплификации и выявления нужной последовательности. Особенно важно наличие комплиментар-

ности 3' -концевых нуклеотидов праймеров в выявляемой генетической структуре,

так как отсутствие данного условия приводит к резкому снижению(в десятки раз)

эффективности присоединения к 3'-концу новых нуклеотидов, что, естественно за-

трудняет последующий рост полинуклеотидной цепи. Конструирование праймеров проводится после определения нуклеотидных последовательностей в исследуемой ДНК методом секвенирования. Существенным образом на успех ПЦР-диагностики влияет и длина амплифицируемого участка ДНК или РНК. В большинстве случаев она должна находиться в диапазоне от100 до 300 нуклеотидов. Для подбора опти-

мальных условий ПЦР с выбранными праймерами применяют различные компью-

терные программы, например, OLIGO. Для анализа сходства испытуемых ДНК с из-

вестными нуклеотидными последовательностями используют данные международ-

ных компьютерных банков Gen Bank и EMBL, поставляющих программы анализа

DNASUN и DNASIS.

2 Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфат

(дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитидинтрифосфат (дЦТФ) и

дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taq-

полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Необходимо помнить, что дНТФ при комнатной температуре легко распадаются, поэтому маточные их растворы разли-

вают по 10 мкл и 20 мкл и хранят в замороженном состоянии при температуре от минус 20 °С до минус 70 °С. Для работы используют размороженные пробы(рабо-

чие образцы), разведенные в 100 раз деионизированной водой (по 2 мкл каждого).

Избыток угнетает активность полимеразы.

3 Taq-ДНК-полимераза (термостабильный фрагмент). Выделена из водорослей

Thermus Aquaticus, живущих в горячих источниках, обладает ДНК-полимеразной ак-

тивностью. Несколько лет назад удалось получить из бактерий Thermus Thermophilis

242

Tth-полимеразу, которая выполняет целый ряд функций, в том числе обеспечивает репарацию и репликацию ДНК и обладает обратнотранскриптазной активностью,

позволяя получать из РНК комплиментарную ДНК. Она способна удлинять корот-

кие олигонуклеотидные последовательности (праймеры), присоединяя к их 3¢-концу дополнительный нуклеотид при условии, что праймер, как уже отмечалось, ком-

плиментарен сайту цепи ДНК (матрице). Наращивание длины праймера с помощью полимеразы происходит до тех пор, пока не будет достигнут конец матрицы. Экспе-

риментально доказано, что процесс амплификации происходит более эффективно при использовании Taq-ДНК-полимеразы.

4 Буферный раствор для обеспечения оптимальных условий работы.

5Ионы магния (Mg2+) – катализатор фермента Taq-ДНК-полимеразы.

6Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, служащий мишенью для последующего многократного копирования(на-

пример, ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК-мишени специфический про-

дукт амплификации не образуется.

7 Положительный контроль – образец ДНК выделяемой биологической систе-

мы.

8 Минеральное масло – наслаивается па поверхность реакционной смеси для предотвращения испарения и разбрызгивания продуктов ПЦР в случаях, если не применяется амплификатор с горячей крышкой.

Приборы.

Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации является при-

борное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР является амплифи-

катор (термоциклер), представляющий собой аппарат, в гнезда которого устанавли-

ваются специальные амплификационные пробирки, изготовленные из особого тер-

мопроводимого пластика, с реакционной смесью или предметные стекла с образца-

ми тканей. Различными фирмами выпускается большое количество разнообразных моделей амплификаторов. Модели отличаются друг от друга системами охлаждения

(водяное, воздушное, фреоном и более надежное и современное – на полупроводни-

ковых кристаллах), способами обогрева (передача тепла через пробирки с жидко243

стью и воздушная передача тепла в микроколориметр для обогрева срезов тканей,

мазков и т.д.), объемом памяти при программировании, режимами регулирования смены температуры (по матрице, активное), количеством платформ (от 1 до 4) – та-

кие модели осуществляют амплификацию по одной и той же программе на несколь-

ких платформах сразу, что позволяет увеличивать число анализируемых одновре-

менно проб или проводить амплификацию на разных платформах по нескольким разным программам для одновременного анализа проб на наличие нескольких типов возбудителей.

Кроме надежности амплификатора и точности поддержания температуры,

следует упомянуть о таком важном свойстве приборов, как использование активного регулирования, позволяющего добиваться достижения нужной температуры реак-

ционной смеси внутри пробирки в существенно более короткие сроки, чем при обычном регулировании. Использование активных методов регулирования темпера-

туры реакционной смеси (в отличие от метода регулирования по матрице) позволяет значительно сокращать процесс амплификации: тем самым уменьшается время ре-

акции (от 1,5 до 2 раз), увеличивается время сохранения активностиTaq-ДНК-

полимеразы, что позволяет увеличить количество циклов амплификации, снизить риск неспецифического отжига праймеров, а, следовательно, повысить чувствитель-

ность и специфичность реакции.

Регулирование по матрице – классический вариант регулирования, при кото-

ром заданный в программе амплификации температурный профиль трактуется как температурный профиль термоблока (матрицы). В этом случае реальная температу-

ра реакционной смеси в пробирке может существенно отличаться от температуры термоблока из-за плохой термопроводности стенок пробирки, наличия контактного теплового сопротивления между матрицей и пробиркой, конечной скорости распро-

странения тепла внутри объема смеси, т.е. ограниченной скорости теплообмена ме-

жду матрицей и пробиркой со смесью. Данный метод был наиболее распространен до последнего времени. При таком регулировании температуры реакционной смеси необходимы довольно продолжительные участки поддержания постоянной темпера-

туры матрицы для того, чтобы температура смеси успела выйти на заданный уро244

На практике температура отжига подбирается опытным путем с использова-

нием положительных и отрицательных контролей. Она находится в диапазоне от

40 °С до 65 °С.

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3'-конца праймера.

Элонгация (синтез).

На данном этапе происходит достраивание праймеров. Температуру реакци-

онной смеси доводят до оптимальной для активностиTaq-ДНК-полимеразы (около

72 °С), которая начинает достраивание второй цепи ДНК из дНТФ. Синтез всегда начинается от 3'-конца каждого праймера. Достраивание новой нити ДНК идет, та-

ким образом, от 5'-конца к 3'-концу каждой имеющейся нити ДНК, т.е. синтез, про-

текает в противоположных друг другу направлениях. Именно поэтому классическую ПЦР называют методом направленной амплификации. Время, необходимое для элонгации, определяется размером продуктов амплификации. Считается, что дост-

раивание 1000 пар нуклеотидов занимает 1 мин. Обычно оно занимает от 40 до 60 с.

В завершение первого цикла ПЦР из одной образуются две новые молекулы ДНК, идентичные оригиналу, но не по всей длине ДНК, а только в тех участках, ко-

торые ограничены присоединением праймеров. То есть дочерние молекулы ДНК идентичны не всей материнской ДНК, а только ее части.

Следует отметить, что во время первого цикла удлинение новой цепочки от праймера заканчивается произвольно. Однако со второго цикла в смеси начинают накапливаться специфические продукты амплификации– ампликоны, которые ог-

раничены по длине двумя праймерами. Именно они и являются непосредственным предметом детекции, которую проводят с помощью электрофореза либо иммуно-

ферментного анализа.

Во втором цикле ПЦР два синтезированных участка ДНК, образованные из одной материнской ДНК, также служат матрицей(шаблоном) для последующих циклов ПЦР. Начиная с третьего цикла, в процессе синтеза образуются отрезки ДНК

(ампликоны) со строго определенным количеством нуклеотидных последовательно-

стей и, соответственно, с определенной молекулярной массой, что позволяет в про247

Экспоненциальный характер увеличения копий ДНК носит только при первых

20 циклах. В дальнейшем в результате истощения дНТФ, праймеров, снижения ак-

тивности Taq-ДНК-полимеразы и др. причин увеличение количества образующихся копий прекращается.

Следуем отметить, что в процессе амплификации на исходной цепи синтези-

руются и длинные фрагменты, однако их накопление происходит лишь в арифмети-

ческой прогрессии:

К = М × n,

где К – количество длинных фрагментов амплификации; n – число циклов амплификации.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах прайме-

рами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Гель-электрофорез.

Как правило, для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в1,5- 3 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Также можно использовать полиакриламидные и более концентрированные агарозные гели. Камера для элек-

трофореза заполняется трис-боратным буфером (рН от 8,1 до 8,2). Для исследования используют от 10 мкл до 20 мкл амплифицированиой ДНК. Электрофорез проводят при высоком напряжении (» от 10 В/см до 15 В/см). По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты.

ПЦР – исследование можно интерпретировать как отрицательное или положитель-

ное в зависимости от того, обнаружена в образце интересующая последовательность или нет (имеет вид компактной светящейся полоски – «бэнда»).

При проведении ПЦР необходимо учитывать возможность контаминации ис-

следуемых проб продуктами амплификации предыдущих опытов. Это может стать причиной появления ложноположительных результатов. Поэтому оборудование,

предназначенное для подготовки проб к ПЦР (микропипетки, центрифуги, пробирки

249