Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

рикции. Поскольку такие сайты (короткие последовательности нуклеотидов) имеют-

ся и в ДНК вируса, они также метилируются, то есть клетка как бы метит «свои» ви-

русы. В разных видах бактерий присутствуют разные эндонуклеазы рестрикции и соответствующие им m-системы. В итоге возникает видовая и даже штаммовая спе-

цифичность систем r-m. В связи с этим, пометив и защитив ДНК вируса, бактери-

альная клетка разрешает размножаться только«своим» вирусам и запрещает репли-

цироваться «чужим», которые перед этим размножались в других штаммах или ви-

дах бактерий.

Целый ряд вирусов бактерий научился сам преодолевать г-систему клетки хо-

зяина за счет приобретения фаговой ДНК хозяйских генов, кодирующих специфиче-

ские метилазы, и таким образом гарантировать себе получение полноценного -по томства. Примером такой приспособляемости бактериофагов является фагT2 (Myoviridae). Паразитизм и высокая приспособляемость бактериофагов могут идти еще дальше. Некоторые фаги (λ, P1 – Syphoviridae) приобрели себе не только т-систему,

но и собственные системы рестрикции. При попадании таких фагов в клетку фагос-

пецифические рестриктазы могут воздействовать на клеточную ДНК, обеспечивая первый этап вирусной инфекции — подавление функции генома клетки хозяина.

8.7 Введение фаговой нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку

Особенности строения бактериальных клеток, имеющих устойчивую к воздей-

ствию факторов внешней среды и относительно жесткую клеточную стенку, опре-

деляют существование ряда отличительных механизмов введения нуклеиновой ки-

слоты бактериофага в клетку хозяина. Остановимся на двух примерах.

1 Введение ДНК в клетку хозяина фагами с сократительным хвостовым отро-

стком происходит с использованием«шприцевого» механизма. Адсорбция фага на клеточной поверхности и введение нуклеиновой кислоты в клетку представляют со-

бой многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором участвуют три струк-

турно и функционально разделенные системы: сенсорная (включает длинные и ко-

роткие хвостовые фибриллы), сократительная (хвостовой чехол) и проводящая (хво201

Продуктивный тип взаимодействия сопровождается наработкой зрелого -ви русного потомства и может завершаться двумя исходами– лизисом клетки и вне-

запным выходом в среду вновь образовавшихся вирионов(литический тип взаимо-

действия) или секрецией вирионов в среду, не сопровождающейся разрушением клетки хозяина (секреторный тип взаимодействия).

При литическом типе взаимодействия к моменту завершения сборки фаговых частиц нарабатываются особые, так называемые, киллерные белки, которые убива-

ют бактериальную клетку, останавливая все метаболические процессы и разрушая клеточную стенку. Зрелые фаговые частицы выходят во внешнюю среду не в- ре зультате механического разрушения бактериальной клетки, а в результате лизиса изнутри. Каждая из этих частиц способна инфицировать чувствительную бактери-

альную клетку и повторить вышеописанный цикл развития.

Уникальное завершение жизненного цикла наблюдается у иновирусов (фаги E. coli f1, M13). Зрелые нитевидные частицы этих фагов секретируются из зараженной клетки без лизиса последней. Иновирусы инфицируют только мужские клетки, так как адсорбируются на кончикахF-пилей. В процессе морфогенеза фаговые белки концентрируются на внутренней поверхности клеточной мембраны, зрелые молеку-

лы ДНК проходят через мембрану, захватывая капсидный белок, и секретируются в среду. Иновирусы выделены из E. coli (фаги f1, fd, M13), Salmonella (фаги if1, if2),

Pseudomonas (фаги Pf1, Pf3), Xanthomonas (бактериофаг Xf), Vibrio (бактериофаг v6).

Особый интерес представляет фагM13. Существование этого вируса в двух формах – репликативной (в форме плазмиды) и секреторной (инкапсидированная однонитевая кольцевая ДНК) делают его удобным инструментом молекулярно-

генетических исследований. Путем различных модификаций генома фага М13 скон-

струирован целый ряд удобных векторов клонирования на основе репликативной формы. Секретируемая одноцепочечная рекомбинантная молекула ДНК широко применяется при определении нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК.

Лизогенный тип взаимодействия. У умеренных бактериофагов первые две стадии жизненного цикла совпадают со стадиями жизненного цикла вирулентных

204

фагов. После введения нуклеиновой кислоты в клетку хозяина умеренные фаги спо-

собны в дальнейшем либо пойти по литическому пути, аналогично вирулентному фагу, либо перейти в особое состояние, получившее название «профаг». При этом генетический материал фага интегрирует в бактериальную хромосому или перехо-

дит в плазмидоподобное состояние и реплицируется синхронно с геномом клетки.

Все бактерии – потомки клетки, инфицированной умеренным фагом, содержат про-

фаг. Такая бактериальная культура называется лизогенной. Лизогенная культура может существовать продолжительное время.

Лизогенная культура обладает следующими свойствами: она устойчива к по-

вторной инфекции данным типом фага или фагами, близкородственными ему; все-

гда содержит небольшое количество зрелых фаговых частиц, о чем свидетельствует спонтанный лизис отдельных клеток в культуре.

Для системы «лизогенная бактерия – профаг» описано явление, получившее наименование индукция. При индукции профаг активизируется во всех клетках ли-

зогенной культуры, в результате чего наблюдается продуктивный цикл развития фа-

га, завершающийся полным лизисом клеток и выходом зрелого фагового потомства.

Индукция может происходить как спонтанно, без видимых причин, так и в результа-

те воздействия определенных факторов, получивших название индукторов. К ин-

дукторам относятся ультрафиолетовое излучение, мутагены, такие как нитрозогуа-

нидин, акридиновые красители и ряд других.

В результате детального изучения различных типов мутантов фага λ было по-

казано, что в формировании и поддержании лизогенного состояния участвует белок cI, получивший название иммунитетный репрессор. Установлено, что белок cI свя-

зывается с фаговой ДНК в районе области иммунности. В этой области на хромо-

сомной карте фага λ, между геном N и геном CII находятся два промотора PR (R –

правый) и PL (L – левый) с соответствующими им операторамиOR и OL. Именно с этими операторами и связывается белок cI, выполняя регуляторную функцию белка-

репрессора.

Блокирование белком cI левого оператора предотвращает синтез мРНК с гена

N, а блокирование правого оператора предотвращает синтез мРНК с геновO и P. 205

Продукты генов N, O, P необходимы для выражения всех остальных генов фага ,λ

поэтому прямое действие репрессора на операторыOR и OL косвенным образом по-

давляет выражение практически всего генома.

Каждый оператор состоит из трех участков длиной16 нуклеотидов, располо-

женных тандемно, и способен связывать от 1 до 3 молекул белка cI. Присоединение хотя бы одной молекулы репрессора предотвращает достижение РНК-полимеразой точки инициации транскрипции.

Существует репрессор синтеза репрессора cI, являющийся продуктом гена его.

В клетке, содержащей геном фага λ, образование репрессора cI и репрессора репрес-

сора cro являются взаимно исключающими состояниями. При лизогенизации и под-

держании лизогении синтезируется репрессорcI и подавлен репрессор репрессора cro. При литической реакции репрессор репрессора образуется, а образование ре-

прессора cI подавлено.

В клетке, инфицированной умеренным фагом λ, могут протекать как события,

приводящие к лизогенизации, так и события, приводящие к продуктивному разви-

тию фага. Выбор определяется соотношением уровня синтеза репрессораcI и уров-

ня синтеза продукта гена его. Так, суперинфицирование нормальным фагом лизо-

генных клеток, содержащих продукт его, всегда приводит к литической реакции, а

суперинфицирование нормальным фагом лизогенной клетки, содержащей репрессор cI, никогда не приводит к литическому ответу.

Кроме продуктов генов cI, cII, cIII, cro, промоторных и операторных участков существенную роль в процессах регуляции выражения генома фага λ играют гены

N, O, P, Q.

Продукт гена N осуществляет позитивный контроль транскрипции всех -ос тальных генов фага λ. При индукции профага, дефектного по гену N, с промотора PL

транскрибируется только сам ген N, а с промотора PR – только ген его. При наличии продукта гена N с обоих промоторов транскрибируются длинные полигенные мРНК. Действие продукта гена N является примером аттенуаторного контроля (ат-

тенуация – регуляция транскрипции на уровне терминации). Аттенуаторные участ-

ки закодированы в ДНК фага λ между генамиN и CIII, между генами его иCII, а 206

также между генами P и Q. Именно в этих точках обрывается синтез мРНК при от-

сутствии продукта гена N.

Под контролем группы генов C, генов его и N находится выражение, так назы-

ваемых, ранних белков, участвующих в рекомбинации фаговой ДНК(int, xis, red, rex), регуляторных белков (cI, cII, cIII, cro, N), белков, участвующих в репликации фаговой хромосомы (С, Р). Ни один из этих белков не относится к компонентам зре-

лой фаговой частицы.

Структурные компоненты фага кодируются поздними генами, расположенны-

ми справа от гена Q. Их выражение начинается после того, как пройдет 1/3 латент-

ного периода. Выражение поздних генов находится под позитивным контролем продуктов генов О, P, Q. Поздние гены транскрибируются в виде единой полиген-

ной мРНК. При отсутствии продуктов генов O и P фаговая ДНК не реплицируется и не синтезируются продукты поздних генов.

Трансдукция. При изучении бактериофагов было открыто явление, получив-

шее название трансдукция – перенос фагом генов бактерии-хозяина от клетки к клетке. Различают специфическую и неспецифическую (общую) трансдукцию.

Специфическая трансдукция впервые описана Ледербергом и его сотрудника-

ми на примере колифага λ.. Они проводили заражение различных типов ауксотроф-

ных мутантов штамма E. coli K12 фагом λ, выращенном на исходном прототрофном штамме K12. Чтобы проверить, не передались ли с помощью бактериофага ауксо-

трофам гены штамма дикого типа, культуры высевали на селективные среды. Ре-

зультаты были в основном отрицательные, ни один из признаков донора не переда-

вался фагом λ лизогенизированным реципиентам. Было лишь одно исключение– бактерии gal- (не способные утилизировать галактозу) с вероятностью 10-6 приобре-

тали от донорского штамма признак gal+. Таким образом, было установлено, что фаг

λ способен переносить (трансдуцировать) гены, но трансдукция носит специфиче-

ский характер и ограничивается только генамиgal, так как ДНК фага λ интегрирует в бактериальную хромосому в непосредственной близости от генаgal. С определен-

ной вероятностью при выщеплении профага λ из состава бактериальной хромосомы происходит ошибка, и наряду с генами фага выходит область gal-гена E. coli, а часть

207

фаговых генов остается в хромосоме. Трансдуцирующий фаг λ (λ gal) является де-

фектным. От 1/4 до 1/3 его генома замещается на областьgal бактериальной хромо-

сомы. Такие фаги не способны к вегетативному размножению, не образуют нега-

тивных колоний на газоне чувствительных бактерий. Однако при попадании в клет-

ку хозяина, они делают ее устойчивой к повторной инфекции фагом .λДефектный фаг размножается и дает структурно полноценное потомство только при наличии фага-помощника (нормального фага λ, присутствующего в клетке-хозяине одновре-

менно с дефектным). Такое возможно при одновременном инфицировании бакте-

рии, как дефектным по гену gal, так и нормальным, диким фагом λ.

Неспецифическая (общая) трансдукция была описана Ледербергом и Тату-

мом несколько раньше, чем специфическая. Это явление было открыто неожиданно,

при попытке изучить половой процесс уSalmonella typhimurium. Для этого был ис-

пользован метод, ранее позволивший продемонстрировать коньюгацию у E. coli. На

синтетическую среду, содержащую только соли и углевод как источник углерода и энергии и не содержащую аминокислот, высевали смесь двух ауксотрофных мутан-

тов S. typhimurium. Один из них нуждался для роста в фенилаланине, триптофане,

тирозине (Phe-, Trp-, Tyr-), другой — в метионине и гистидине(Met-, His-). Одна из

100 000 колоний образовывала прототрофные колонии. Они являлись результатом генетической рекомбинации этих двух штаммов, в котором объединились аллели дикого типа Phe+, Trp+, Tyr+ от одного штамма и Met+, His+ – от другого. Был сделан

вывод, что у Salmonella, как и у Escherichia, может происходить генетический об-

мен, в результате которого образуются рекомбинанты с генетическими признаками разных предков. Однако, в отличие отE. coli, Для образования рекомбинантов у сальмонелл не требуется контакта между родительскими клетками. Обмен генов происходил за счет фагаP22, который содержался в одном из родительских штам-

мов в форме профага.

Фаг P22 способен трансдуцировать любой генSalmonella. Такой вариант трансдукции получил наименование «общая», «неспецифическая». Было выяснено,

что частота трансдукции для всех генов приблизительно одинакова и невысока –

10-5. Одновременно несколько признаков (генов), как правило, не передаются. Ис208