Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

русы, фаг N4).

днДНК мРНК

3 онДНК, которая прежде чем транскрибироваться должна перейти в двухни-

тевую форму (парвовирусы, включая дефектные вирусы, требующие для размноже-

ния наличия вируса-помощника).

онДНК днДНК мРНК

4 Кольцевая частично двухнитевая днДНК(вирус гепатита B, вирус мозаики цветной капусты). Прежде чем транскрибироваться, ДНК проходит стадию репара-

ции.

3.7.2.4 Регуляция транскрипции

В вирусных и клеточных системах молекулярные механизмы транскрипции принципиально сходны. Отличие заключается в существовании различных способов регуляции транскрипции вирусных геномов. Необходимость такой регуляции опре-

деляется разной потребностью в вирусоспецифических белках. Структурные белки,

как правило, требуются в больших количествах, чем белки-ферменты. Кроме того,

на ранних стадиях инфекции нужны белки, обеспечивающие репликацию вирусного генома, а на поздних – структурные белки. Поэтому целесообразно, чтобы разные вирусные гены считывались с разной эффективностью, и эта эффективность меня-

лась во времени.

Процесс транскрипции регулируется на уровне транскриптона(оперона) за счет работы репрессоров и активаторов белковой природы и энхансеров(усилите-

лей), которые представляют собой определенные короткие последовательности ге-

номной нуклеиновой кислоты. Транскрипция регулируется количественно и качест-

венно и осуществляется как клеточными, так и вирус-специфическими механизма-

ми.

У вирусов установлено существование целого ряда способов регуляции транс101

крипции.

Временной тип регуляции. У ДНК-содержащих вирусов существует три -пе риода транскрипции: сверхранний, ранний и поздний. При сверхранней и ранней транскрипции считываются сверхранние и ранние гены, при поздней – поздние ге-

ны. Количество транскриптов поздних генов превышает количество ранних. Многие сверхранние мРНК являются генамиNS белков-ферментов и регуляторов транс-

крипции и репликации. Поздние мРНК являются генами структурных белков. Фак-

тором регуляции транскрипции у ядерных вирусов является транспорт мРНК в ци-

топлазму.

Каскадный тип регуляции транскрипции генов. Суть такой регуляции заклю-

чается в том, что продукты сверхранней транскрипции, например, α-белки, необхо-

димы для транскрипции другой группы генов, кодирующих β-белки, которые, в

свою очередь, включают транскрипцию следующей группы генов – γ-белков.

Полярный тип регуляции определяется порядком расположения генов в гено-

ме. Количество синтезируемых молекул полипептида зависит от расстояния между геном и промотором. Вдоль генома (-)РНК вирусов существует как бы градиент эф-

фективности транскрипции. Чаще транскрибируются гены 3'-региона, реже – гены

5'-конца.

Взаимное расположение и сила регуляторных сигналов. Считывание или не-

считывание транскрибируемого участка матрицы зависит от свойств и расположе-

ния регуляторных сигналов– промоторов (обеспечивают начало транскрипции) и

терминаторов (обеспечивают прекращение транскрипции). Основа регуляции – вза-

имное расположение регуляторных сигналов и их сила. Активность сигналов может меняться во времени.

Характер образования транскриптов и способ регуляции зависят от того, име-

ем ли мы дело с вирусами прокариот или эукариот. Напомним, что в клетках прока-

риот возможна множественная инициация трансляции на полицистронной матрице,

тогда как в клетках эукариот на РНК реализуется только одна точка инициаци трансляции и эта мРНК функционально моноцистронна. Ограничения, накладывае-

мые клеткой хозяина, в первую очередь сказываются на механизмах транскрипции и

102

посттранскрипционного созревания мРНК. Приведем конкретные примеры спосо-

бов регуляции транскрипции вирусных геномов в клетках прокариот и эукариот.

Самый простой способ регуляции транскрипции в клетках прокариот установ-

лен у фагов 1М13 и fd, где разная степень экспрессии фаговых генов регулируется за счет расположения и силы промоторов. За счет наличия «сильных» промоторов активно транскрибируются гены, кодирующие основной структурный белок капсида и ДНК-связывающий белок. В то же время, геномная последовательность, коди-

рующая минорные вирусные белки, имеет промоторы, отнесенные к разряду «сла-

бых».

Более сложная регуляция транскрипции генов наблюдается у фага λ, имеюще-

го, как минимум, три типа регуляции транскрипции: 1) ретро-регуляция – осуществ-

ляется при участии нуклеотидных последовательностей, расположенных за транс-

крибируемым геном. Этот участок комплементарен предшествующему участку гена и в образовавшемся транскрипте возникает внутримолекулярная двухнитевая струк-

тура, которая впоследствии разрушается РНКазой III; 2) аутогенная регуляция – ре-

гуляция активности гена при помощи продукта этого же гена; 3) индукция профага – наблюдается в результате инактивации репрессора.

Для бактериофагов показана реализация временного типа регуляции транс-

крипции, что связано с существованием ранних, средних и поздних генов и соответ-

ствующих им промоторов. Так, у фага Т4 структура ранних промоторов близка к та-

ковой промоторов клетки хозяина и именно они сразу узнаются клеточной РНК-

полимеразой. Последующая активация средних генов связана с фагоспецифическим белком – продуктом трансляции раннего гена. Система регуляции транскрипции ге-

нов фага Т4 включает еще один уникальный механизм– ковалентную и некова-

лентную модификацию РНК-полимеразы, способствующую узнаванию ею поздних промоторов. Модифицированная РНК-полимераза перестает узнавать промоторы ранних генов.

Еще один способ временной регуляции наблюдается у фага7. ТСуть этого способа заключается в том, что одним из продуктов ранних генов, транскрибиро-

ванных клеточной РНК-полимеразой, является фаговая РНК-полимераза, которая

103

он подчинен строгой регуляции и чрезвычайно чувствителен к внутриклеточной и внеклеточной окружающей среде. В общих чертах, трансляция э-мРНК может изме-

няться в зависимости от концентрации энергетических субстратов, в ответ на мито-

генное возбуждение и регуляцию клеточного цикла, стресс, и вирусную инфекцию.

Вирусное трансляционное программирование. Специализированный при-

родный аппарат синтеза белка высоко сохранен у прокариот и эукариот и охватыва-

ет более чем 30 различных генных продуктов, что требует большого размера генома.

Таким образом, имеющая место трансляционная зависимость вирусов исключает необходимость кодирования компонентов для автономного вирусного белкового синтеза.

Вирусы эукариот развили эффективные средства эксплуатации их врожденной трансляционной зависимости через механизмы трансляционного программирова-

ния. Это процесс, в котором вирусы перестраивают трансляционный аппарат хозяи-

на для обеспечения синтеза вирусных белков и управлять экспрессией продуктов собственных генов. Последнее особенно важно для РНК-содержащих вирусов, кото-

рые имеют ограниченный транскрипционный контроль и в основном полагаются на стратегии регуляции трансляции, которые и модулируют выражение вирусных ге-

нов.

Трансляционное программирование включает: 1) использование регуляции выше открытой рамки считывания (uORFs); 2) чтение перекрывающихся рамок счи-

тывания; 3) трансляцию мультицистронных мРНК; 4) контроль терминации транс-

ляции. Это позволяет вирусам сохранять минимальный размер генома, делая его эффективным в кодирующей способности. Вообще, механизмы трансляционного программирования заложены непосредственно в структуре мРНК вирусов. Струк-

турные элементы в пределах вирусных мРНК, которые затрагивают ее трансляцион-

ную эффективность или осуществляют трансляционный контроль, включают: длину и структурную сложность5’- и 3’- нетранслируемых регионов (НТР), позицию и контекст инициирующего кодонаAUG, стабильность и доступностьm7G-кэпа и кэп-связывающего комплекса и положениеuORF(s) предшествующего гена. Кроме этого, активные элементы нуклеотидной последовательности, которые связывают

107

регуляторные факторы, могут передавать дополнительный уровень трансляционно-

го управления на в-мРНК, облегчая трансляционную селективность. Вирусное трансляционное программирование воздействует на все уровни процесса трансля-

ции, включая инициацию, элонгацию, терминацию и трансляционный контроль сиг-

нальных путей хозяина.

Инициация трансляции. Основной контроль трансляции мРНК в эукариотиче-

ских клетках происходит в процессе инициирования. Инициирование трансляции является процессом, в котором мРНК собирается в макромолекулярный комплекс с компонентами, требуемыми для синтеза белка, включая эукариотические факторы инициации (eIF) и факторы элонгации (EF). Инициация начинается с закрепления инициатора метионил-тРНК (Met-tRNAi) с 40S субъединицей рибосомы через фор-

мирование тройного комплекса eIF2-GTP-Met-tRNAi. В этом случае IF2 вероятнее всего связывается непосредственно с А-участком рибосомы и облегчает закрепление

Met-tRNAi с Р-участком рибосомы. IF2 не является регуляторным белком и поэтому не может вносить вклад в регуляцию трансляции мРНК. Напротив, формирование

EIF2-зависимого тройного комплекса и его объединение сMet-tRNAi и 40S субъе-

диницей рибосомы может лимитировать скорость инициации, если альфа субъеди-

ница eIF2 (eIF2a) фосфорилируется специфическим белком киназой. Таким образом,

фосфорилирование eIF2a представляет главную точку контроля над процессом ини-

циации трансляции, так как изменяет эффективность и темп трансляции мРНК. EIF2

направляет тройной комплекс к40S субъединице рибосомы, чтобы сформировать

43S комплекс прединициирования, который включает еще один фктор– eIF3. еIF3

облегчает закрепление 43S комплекса прединициирования на мРНК через -кэп связывающий комплекс eIF4F, который независимо собирается вокругm7G-кэп структуры мРНК.

Сборка eIF4F комплекса на мРНК зависит отeIF4E копонента этого комплек-

са, который узнает и непосредственно связываетm7G-кэп. Сродство eIF4E к m7G-

кэпу является второй главной контрольной точкой в процессе инициации трансля-

ции, которое изменяется через фосфорилированиеeIF4E. Кроме этого, кэп-

связывающая активность eIF4E может быть блокирована через формирование ком108

Рибосомное сканирование и выбор сайтаAUG. После ассоциации с мРНК, 43S прединициирующий комплекс начинает сканирование мРНК от5’-конца или, в

случае кеп-независимой трансляции, входного сайта рибосомы, и продолжает ска-

нирование до Met-tRNAi и взаимодействия с инициирующим кодономAUG. Рибо-

сомное сканирование не всегда совместимо с мРНК, которые обладают длинным и/или структурированным 5’-НТР.

Вирусы обладают механизмами, которые позволяют прединициирующему комплексу эффективно избегать большей части5’-НТР и начинать сканирование в пределах области инициирующего кодона AUG вирусной мРНК. Первая ассоциация

Met-tRNAi с инициирующим кодоном AUG приводит к гидролизу GTP в тройном комплексе, связанные факторы инициирования освобождаются и60S субъединица рибосомы присоединяется к прединициирующему комплексу. В результате 80S

инициирующий комплекс опосредует стадию элонгации трансляции. В этой модели,

инициация начинается с5’-проксимального AUG кодона. Однако выбор кодона

AUG для инициации трансляции зависит частично от его контекста, где канониче-

ская accAUGg последовательность проявляет самую высокую активность к иниции-

рованию. Отступление от этой последовательности связано с так называемым -не герметичным сканированием, в котором прединициирующий комплекс редко при-

знает неканонический или слабыйAUG и сканирует мимо, чтобы начать трансля-

цию с кодона, более соответствующего каноническому инициирующему AUG.

Негерметичное сканирование при инициации трансляции популярно среди ви-

русов, а у ретровирусов оно может обеспечивать определенные стехиометрические взаимоотношения продуктов трансляции.

Удлинение. В течение стадии элонгации трансляции мРНК связана со многи-

ми 80S рибосомами, или полисомами, поскольку аминокислотные остатки последо-

вательно присоединяются к СООН-концу растущей цепи пептидов. Во многих ви-

русных системах жизненный цикл разграничен на ранние и поздние события, кото-

рые могут различаться дифференцированным привлечением вирусных мРНК в по-

лисомные комплексы в определенное время после инфекции. Например, у вируса простого герпеса (HSV-1) это часто совпадает с синтезом факторов латентности и

110