Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных
.pdfnt – (nucleotide) нуклеотид
ORF – (open reading frame) открытая рамка считывания
PAGE – полиакриламидный гель
PR – протеаза
РrР – приемный протеин
RT – (reverse transcriptase) обратная транскриптаза
RT – обратная транскриптаза
sgRNA – (subgenomic RNA) субгеномная РНК
SH – интегративный мембранный протеин
SP – сериновая протеаза
ss – (single-stranded) одноцепочечный ssDNA – односпиральная ДНК ssRNA – односпиральная РНК
ssRNA-RT – односпиральная РНК в репликативном цикле которой имеется этап об-
ратной транскрипции
SU – (surface) поверхностный
T – (triangular number) триангулярное число
VPg – (genome-linked protein) геном-ассоциированный протеин
VP – структурные белки, входящие в состав вирусной частицы
БСА – альбумин нормальной сыворотки быка
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИБ – метод иммуноблотинга
ИД50 – 50 % инфекционная доза для животных или для куриных эмбрионов
иРНК – информационная рибонуклеиновая кислота
ИФА – иммунофлюоресцентный анализ
ИЭМ – иммунная электронная микроскопия
ИЭТ – изоэлектрическая точка
кДНК – клеточная дезоксирибонуклеиновая кислота
КПЧ – клетки почек человека
ЛД50 – 50 % смертельная доза
11
М – матриксный протеин
ММГ – методы молекулярной гибридизации
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
МФА – метод иммунофлюоресценции
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЭГ – полиэтиленгликоль
РБО – реакция бляшкообразования
РВИЭФ – реакция встречного иммуноэлектрофореза
РГА – реакция гемагглютинации
РГАд – реакции гемадсорбции
РЗБО – реакция задержки (нейтрализации) бляшкообразования
РЗЦПД – реакция задержки цитопатического действия вирусов
РИФ – реакция иммунофлюоресценции
РН – реакция нейтрализации
РНК – рибонуклеиновая кислота
РРГ – реакция радиального гемолиза
рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота
РСК – реакция связывания комплемента
РСР – папаино-подобная цистеиновая протеаза
РТГА – реакция торможения гемагглютинации
РТГАд – реакция торможения гемадсорбции
СА – (capsid protein) капсидный протеин
СР – (capsid protein) капсидный протеин
СРЕ – (cytopathic effect) ЦПЭ, цитопатический эффект
ТКИД50 – 50 % инфекционная доза для тканевой культуры
ТМ – (transmembrane) трансмембранный
тРНК – транспортная рибонуклеиновая кислота
УФ – ультрафиолет
ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат
ФЭЧ – фибробласты эмбриона человека
12
ЦПД – цитопатическому действию
ЭМВ – электронно-микроскопическое выявление
13
1История вирусологии, природа и происхождение вирусов
1.1Открытие вирусов
Вирусология — молодая наука, ее история насчитывает немногим более100
лет. Начав свой путь как наука о вирусах, вызывающих болезни человека, животных и растений, в настоящее время вирусология развивается в направлениях изучения основных законов современной биологии на молекулярном уровне, основываясь на том, что вирусы являются частью биосферы и важным фактором эволюции органи-
ческого мира.
История вирусологии необычна тем, что один из ее предметов— вирусные болезни — стал изучаться задолго до того, как были открыты собственно вирусы.
Начало истории вирусологии— это борьба с инфекционными заболеваниями и только впоследствии — постепенное раскрытие источников этих болезней. Под-
тверждением тому служат работы Эдуарда Дженнера(1749-1823 гг.) по предупреж-
дению оспы и работы Луи Пастера (1822-1895 гг.) с возбудителем бешенства.
С незапамятных времен оспа была бичом человечества, унося тысячи жизней.
Описания оспенной заразы встречаются в рукописях древнейших китайских и -ин дийских текстов. Первые упоминания об эпидемиях оспы на европейском континен-
те датируются VI столетием нашей эры (эпидемия среди солдат эфиопской армии,
осаждавшей Мекку), после чего наблюдался необъяснимый период времени, когда упоминания об эпидемиях оспы отсутствовали. Оспа снова начала гулять по конти-
нентам в XVII веке. Например, в Северной Америке (1617-1619 гг.) в штате Масса-
чусетс погибло 9/10 населения, в Исландии (1707 г.) после эпидемии оспы от 57 тыс.
человек осталось только 17 тыс., в г. Истхем (1763 г.) от 1331 жителя осталось 4 че-
ловека. В связи с этим, проблема борьбы с оспой стояла очень остро.
Методика предупреждения оспы через прививку, называемая вариоляцией,
была известна с давних времен. Упоминания о применении вариоляции в Европе да-
тируются серединой 17-го века со ссылками на более ранний опыт применения в Китае, на Дальнем Востоке, в Турции. Суть вариоляции заключалась в том, что со-
14
держимое пустул от пациентов, болевших легкой формой оспы, вносили в малень-
кую ранку на коже человека, что вызывало легкое заболевание и предупреждало острую форму. Однако при этом сохранялась большая опасность заболевания тяже-
лой формой оспы и смертность среди привитых достигала10 %. Дженнер совершил переворот в методике предупреждения оспы. Он первый обратил внимание на то,
что люди, переболевшие коровьей оспой, которая протекала легко, впоследствии никогда не болели оспой. 14 мая 1796 г. Дженнер внес в ранку Джеймса Фипса, ни-
когда не болевшего оспой, жидкость из пустул больной коровьей оспой доярки Са-
ры Селмес. На месте искусственной инфекции у мальчика появились типичные пус-
тулы, которые через 14 дней исчезли. Тогда Дженнер внес в ранку мальчика высо-
коинфекционный материал из пустул больного оспой. Мальчик не заболел. Так за-
родилась и подтвердилась идея вакцинации(от латинского слова vacca — корова).
Во времена Дженнера вакцинация понималась как внесение инфекционного мате-
риала коровьей оспы в организм человека с целью предотвращения заболевания на-
туральной оспой. Термин вакцина применяли к веществу, предохранявшему от ос-
пы. С 1840 г. противооспенную вакцину стали получать заражением телят. Вирус оспы человека был открыт только в1904 г. Таким образом, оспа — это первая ин-
фекция, против которой была применена вакцина, т. е. первая управляемая инфек-
ция. Успехи в вакцинопрофилактике черной оспы привели к ее искоренению в ми-
ровом масштабе.
В наше время вакцинация и вакцина употребляются как общие термины, обо-
значающие прививку и прививочный материал.
Пастер, по существу не знавший ничего конкретного о причинах бешенства,
кроме неоспоримого факта его инфекционной природы, использовал принцип ос-
лабления (аттенуации) возбудителя. В целях ослабления болезнетворных свойств возбудителя бешенства был использован кролик, в мозг которого ввели мозговую ткань умершей от бешенства собаки. После смерти кролика мозговая ткань его была введена следующему кролику и .т д. Было проведено около 100 пассажей, прежде чем возбудитель адаптировался к ткани мозга кролика. Будучи введен подкожно в организм собаки, он проявлял лишь умеренные свойства патогенности. Такой «пе-
15
ревоспитанный» возбудитель Пастер назвал «фиксированным», в отличие от «дико-
го», которому свойственна высокая патогенность. Позднее Пастер разработал метод создания иммунитета, состоящий из серии инъекций с постепенно увеличивающим-
ся содержанием фиксированного возбудителя. Собака, прошедшая полный курс инъекций, оказалась в полной мере устойчивой к инфекции. Пастер пришел к выво-
ду, что процесс развития инфекционной болезни, по существу, является борьбой микробов с защитными силами организма. «Каждая болезнь должна иметь своего возбудителя, а мы должны способствовать развитию иммунитета к этой болезни в организме пациента», — говорил Пастер. Еще не понимая, каким образом организм вырабатывает иммунитет, Пастер сумел использовать его принципы и направить механизмы этого процесса на пользу человека. В июле 1885 г. Пастеру представился случай испытать свойства«фиксированного» возбудителя бешенства на ребенке,
укушенном бешеной собакой. Мальчику была проведена серия инъекций все более ядовитого вещества, причем последняя инъекция содержала уже полностью пато-
генную форму возбудителя. Мальчик остался здоров. Вирус бешенства был открыт Ремленже в 1903 г.
Следует отметить, что ни вирус оспы, ни вирус бешенства не были первыми открытыми вирусами, поражающими животных и человека. Первое место по праву принадлежит вирусу ящура, открытому Леффлером и Фрошем в1898 г. Эти иссле-
дователи, используя многократные разведения фильтрующегося агента, показали его ядовитость и сделали заключение о его корпускулярной природе.
К концу XIX-го столетия выяснилось, что целый ряд заболеваний человека,
таких как бешенство, оспа, грипп, желтая лихорадка являются инфекционными, од-
нако их возбудители не обнаруживались бактериологическими методами. Благодаря работам Роберта Коха (1843-1910 гг.), который впервые использовал технику чис-
тых бактериальных культур, появилась возможность различать бактериальные и не-
бактериальные заболевания. В 1890 г. на X конгрессе гигиенистов Кох вынужден был заявить, что «…при перечисленных болезнях мы имеем дело не с бактериями, а
с организованными возбудителями, которые принадлежат к совсем другой группе микроорганизмов». Это высказывание Коха свидетельствует, что открытие вирусов
16
не было случайным событием. Не только опыт работы с непонятными по своей при-
роде возбудителями, но и понимание сущности происходящего способствовали то-
му, что была сформулирована мысль о существовании оригинальной группы возбу-
дителей инфекционных заболеваний небактериальной природы. Оставалось экспе-
риментально доказать ее существование.
Первое экспериментальное доказательство существования новой группы воз-
будителей инфекционных заболеваний было получено нашим соотечественником — физиологом растений Дмитрием Иосифовичем Ивановским(1864-1920 гг.) при изу-
чении мозаичных заболеваний табака. Это неудивительно, так как инфекционные заболевания эпидемического характера часто наблюдались и у растений. Еще в
1883-84 гг. голландский ботаник и генетик де Фриз наблюдал эпидемию позелене-
ния цветов и предположил инфекционную природу заболевания. В 1886 г. немецкий ученый Майер, работавший в Голландии, показал, что сок растений, больных моза-
ичной болезнью, при инокуляции вызывает у растений такое же заболевание. Майер был уверен, что виновником болезни является микроорганизм, и безуспешно искал его. В 19 веке заболевания табака наносили огромный вред сельскому хозяйству и в нашей стране. В связи с этим, для изучения заболеваний табака на Украину была направлена группа исследователей, в которую, будучи студентом Петербургского университета, входил Д.И. Ивановский. В результате изучения заболевания, описан-
ного в 1886 г. Майером как мозаичная болезнь табака, Д.И. Ивановский и В.В. По-
ловцев пришли к выводу, что оно представляет собой два различных заболевания.
Одно из них — «рябуха» — вызывается грибком, а другое — неизвестного проис-
хождения. Изучение мозаичной болезни табака было продолжено Ивановским в Ни-
китском ботаническом саду под руководством академика А.С. Фамицина. Используя сок пораженного болезнью листа табака, профильтрованный через свечу Шамбер-
лана, задерживающую самые мелкие бактерии, Ивановский вызвал заболевание ли-
стьев табака. Культивирование зараженного сока на искусственных питательных средах не дало результатов и Ивановский приходит к выводу, что возбудитель бо-
лезни имеет необычную природу — он фильтруется через бактериальные фильтры и не способен расти на искусственных питательных средах. Прогревание сока при
17
температуре от 60 °С до 70 °C лишало его инфекционности, что свидетельствовало о живой природе возбудителя. Ивановский сначала назвал новый тип возбудителя
«фильтрующиеся бактерии» (рисунок 1). Результаты работы Д.И. Ивановского были положены в основу его диссертации, представленной в 1888 г., и опубликованы в книге «О двух болезнях табака» в 1892 году. Этот год и считается годом открытия вирусов.
А – Электронная микрофотография после косого напыления углеродом и пла-
тиной; 65 000 ´. (Фото Н. Frank.) Б – Модель. (Karlson, Kurzes Lehrbuch der Biochemie, Stuttgart, Thieme, 1980).
Рисунок 1 – Вирус табачной мозаики
Определенный период времени в зарубежных публикациях открытие вирусов связывали с именем голландского ученого Бейеринка (1851-1931 гг.), который также занимался изучением мозаичной болезни табака и опубликовал свои опыты в 1898 г.
Профильтрованный сок зараженного растения Бейеринк поместил на поверхность агара, проинкубировал и получил на его поверхности бактериальные колонии. По-
сле этого верхний слой агара с колониями бактерий был удален, а внутренний слой был использован для заражения здорового растения. Растение заболело. Из этого Бейеринк сделал вывод, что причиной заболевания являются не бактерии, а некая жидкая субстанция, которая могла проникнуть внутрь агара, и назвал возбудителя
18
«жидкий живой контагий». В связи с тем, что Ивановский только подробно описал свои опыты, но не уделил должного внимания небактериальной природе возбудите-
ля, возникло недопонимание ситуации. Известность работы Ивановского приобрели только после того, как Бейеринк повторил и расширил его опыты и подчеркнул, что Ивановский впервые доказал именно небактериальный характер возбудителя самой типичной вирусной болезни табака. Сам Бейеринк признал первенство Ивановского и в настоящее время приоритет открытия вирусов Д.И. Ивановским признан во всем мире.
Слово ВИРУС означает яд. Этот термин применял еще Пастер для обозначе-
ния заразного начала. Следует отметить, что в начале 19 века все болезнетворные агенты назывались словом вирус. Только после того, как стала понятна природа бак-
терий, ядов и токсинов терминами«ультравирус», а затем просто«вирус» стали обозначать «новый тип фильтрующегося возбудителя». Широко термин «вирус» укоренился в 30-е годы нашего столетия.
В настоящее время ясно, что вирусы характеризуются убиквитарностью, то есть повсеместностью распространения. Вирусы поражают представителей всех царств живого: человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растения, гри-
бы, бактерии.
Первое сообщение, имеющее отношение к вирусам бактерий было сделано Ханкин в 1896 г. В Летописи Института Пастера он заявил, что «... вода некоторых рек Индии обладает бактерицидным действием...», что без сомнения связано с виру-
сами бактерий. В 1915 г. Туорт в Лондоне, изучая причины лизиса бактериальных колоний, описал принцип передачи «лизиса» новым культурам в ряду поколений.
Его работы, как это часто бывает, фактически оказались не замеченными, и два года спустя, в 1917 г., канадец де Эрелль повторно обнаружил явление лизиса бактерий,
связанного с фильтрующимся агентом. Он назвал этот агент бактериофагом. Де Эрелль предполагал, что бактериофаг один. Однако исследования Барнета, рабо-
тавшего в Мельбурне в 1924-34 гг., показали широкое разнообразие бактериальных вирусов по физическим и биологическим свойствам. Открытие многообразия бакте-
риофагов вызвало большой научный интерес. В конце 30-х годов трое исследовате19
лей — физик Дельбрюк, бактериологи Лурия и Херши, работавшие в США, создали так называемую «Фаговую группу», исследования которой в области генетики бак-
териофагов в конечном итоге привели к рождению новой науки— молекулярной биологии.
Изучение вирусов насекомых существенно отстало от вирусологии позвоноч-
ных животных и человека. В настоящее время ясно, что вирусы, поражающие насе-
комых, условно можно разделить на 3 группы: собственно вирусы насекомых, виру-
сы животных и человека, для которых насекомые являются промежуточными хозяе-
вами, и вирусы растений, которые также поражают насекомых.
Первый вирус насекомых, который был идентифицирован — вирус желтухи шелковичного червя (вирус полиэдроза тутового шелкопряда, названный Bollea stilpotiae). Еще в 1907 г. Провачек показал, что фильтрованный гомогенат больных ли-
чинок является инфекционным для здоровых личинок тутового шелкопряда, но только в 1947 г. немецкий ученый Бергольд обнаружил палочковидные вирусные частицы.
Одним из наиболее плодотворных исследований в области вирусологии явля-
ется изучение Ридом природы желтой лихорадки на волонтерах армии США в19001901 гг. Убедительно было продемонстрировано, что желтая лихорадка вызывается фильтрующимся вирусом, который передавался комарами и москитами. Было также установлено, что москиты после впитывания инфекционной крови в течение двух недель остаются неинфекционными. Таким образом, был определен внешний инку-
бационный период заболевания (время, необходимое для репродукции вируса в на-
секомом) и установлены основные принципы эпидемиологии арбовирусных инфек-
ций (вирусных инфекций, передаваемых кровососущими членистоногими).
Способность размножения вирусов растений в своем переносчике— насеко-
мом была показана в1952 г. Мараморошу. Исследователь, используя технику инъ-
екций насекомым, убедительно показал способность вируса желтухи астр размно-
жаться в своем переносчике — шеститочечной цикаде.
20