Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

парами последовательностей, в пределах которых имеются гомологичные последо-

вательности. Это консервативная рекомбинация. Например, при интеграции ДНК фага λ в рекомбинации участвуют два совершенно определенных участка вирусного и хозяйского геномов – attP и attB, соответственно. Эти участки имеют одинаковые сердцевины, но разные «плечи». Соответственно, фаговая последовательность обо-

значается как POP', клеточная – ВОВ'. В результате интеграции образуется участок ВОР'-----РОВ'. Для осуществления интеграции необходима интеграза(топоизомера-

за I) и клеточный белок IHF (клеточный фактор интеграции). Интегрированный ви-

русный геном существует в видепрофага и может выщепляться с участием виру-

соспецифического белка;

б) интеграция и репликация в процессерепликативной транспозиции. Транс-

позон – последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.

Явление репликативной транспозиции установлено для транспозирующего фага Mu. Геном фага – линейная днДНК, размером 30 т.п.н., имеет на концах кле-

точные, а не вирусные нуклеотидные последовательности, то есть всегда находится в состоянии профага. После попадания вируса в клетку, ДНК приобретает форму,

близкую кольцевой, сближая концы. Вирус-специфический белок вносит одноните-

вые разрывы как в клеточные последовательности фаговой ДНК, так и в ДНК клет-

ки-хозяина. Разрывы могут происходить практически в любом месте ДНК. Высту-

пающие 5'-концы клеточной ДНК ковалентно соединяются с3'-концами вирусной ДНК. Лишние концы удаляются, бреши репарируются и фаговый геном оказывается встроенным в геном клетки хозяина. Особенностью репликации фага Mu является то, что она идет без выщепления профага. Копии ДНК, образуемые в процессе реп-

ликации, эффективно внедряются в новые места ДНК хозяина.

3.7.2 Транскрипция

Транскрипция – первая стадия реализации генетической информации, на кото-

рой последовательность геномной нуклеиновой кислоты копируется в виде нуклео91

тидной последовательности мРНК. В основе механизма копирования лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при матрич-

ном синтезе.

3.7.2.1 Основные принципы и механизмы транскрипции у вирусов

Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами. В транскрип-

ции ДНК-геномов вирусов принимает участие ДНК-зависимая РНК-полимераза II, в

редких случаях – РНК-полимераза III. В транскрипции РНК-геномов участвует уни-

кальный вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза.

Большинство ядерных ДНК-содержащих вирусов используют для транскрип-

ции клеточную РНК-полимеразуII. Поксвирусы (цитоплазматические ДНК-

содержащие вирусы) содержат свою ДНК-зависимую РНК-полимеразу, имеющую,

тем не менее, сходство с РНК-полимеразой II. Часто вирусы бактерий для ранней транскрипции своих генов используют клеточную РНК-полимеразу II, а для поздней

– собственную вновь синтезированную транскриптазу. В то же время, этот фермент может входить и в состав вириона.

В 1970 г. Балтимор с соавторами продемонстрировали наличие в составе ви-

риона вируса везикулярного стоматита РНК-зависимой РНК-полимеразы. Позже этот фермент был найден у арена-, бунья-, орто- и парамиксо-, реовирусов, то есть у вирусов с (-)РНК и днРНК-геномом. У (+)РНК-содержащих вирусов РНК-

полимераза детерминирована геномом. РНК-зависимые РНК-полимеразы обладают как транскриптазной, так и репликазной активностью.

Общие принципы транскрипции геномов вирусов сходны с таковыми для кле-

ток про- и эукариот. Индивидуальные особенности проявляются на стадиях -по сттранскрипционного процессинга (созревания) мРНК и регуляции транскрипции.

Синтез молекул РНК начинается в определенном месте матрицы, называемом про-

мотором и заканчивается в определенном месте, называемом терминатором. Уча-

сток ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции – транскриптон. В пределах транскриптона копируется только одна

92

концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности(-70 нуклеоти-

дов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома.

Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательно-

сти, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

(+)РНК (-)РНК мРНК

2 (-)РНК-геномы. Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность кото-

рой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации.

Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все ви-

русы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть не-

прерывны, а могут быть сегментированы.

Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного(-

)РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, уста-

новленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах меж-

ду участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специ-

альные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи(+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3'- к 5'-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой ки-

слоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А

последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5'-

концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспеци-

фических ферментов.

Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных(-)РНК геномов.

Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегмен-

тами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Виру-

соспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5'-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит

95

5 Амбисенс (обоюдозначащая, амбиполярная) РНК. Амбиполярная РНК имеет

5'-конец позитивной полярности, а 3'-конец негативной полярности. При попадании в клетку с геномной РНК считываются два класса комплементарных РНК: с 3'-конца считывается субгеномная мРНК и полноразмерный антигеном. Антигеном, в свою очередь, опять служит матрицей для двух классов РНК. С антигенома считывается вторая субгеномная мРНК и полноразмерная обоюдозначащая геномная, которая идет на построение вирусных частиц.

3.7.2.3 Особенности транскрипции ДНК-геномов вирусов

Каждая клетка млекопитающих содержит приблизительно6×109 пар азоти-

стых оснований ДНК и > 104 активных промотора. Это создает определенные труд-

ности для вирусной ДНК, т.к. вирусные промоторы должны эффективно конкуриро-

вать за использование клеточного транскрипционного аппарата, завербованный

аппарат клетки должен эффективно генерировать вирусные транскрипты. Для этого ДНК-вирусы осуществляют стратегию эффективного инициирования транскрипции на вирусной ДНК в одном или более специфическом промоторе вскоре после того,

как ДНК введена в ядро.

Эти промоторы непосредственно управляют транскрипцией так называемых

ранних генов.

Энхансеры (гены – усилители). Для того чтобы элементы клеточного транс-

крипционного аппарата могли взаимодействовать с ранними вирусными промото-

В отличие от промоторов, они могут активизировать транскрипцию, находясь выше или ниже сайта связывания, запускающего транскрипцию, со скоростью от тысячи пар азотистых оснований(биты) в секунду. Эта особенность определенных энхансеров подчеркивает конкурентоспособное преимущество к связыванию с -ви русными промоторами. Действительно, высокая активность энхансера/промотора

97

ранних генов цитомегаловируса определяет его частое использование в векторах экспрессии. Хотя клеточные гены часто содержат энхансеры, первый ген-усилитель был обнаружен у полиомавируса SV40. Энхансер SV40 состоит из двух тандемных дупликаций 72 п.н., которые содержат сайты связывания, по крайней мере, для шес-

ти различных факторов транскрипции, включая множественные сайты связывания для некоторых факторов. Необходимым условием для оптимальной функции энхан-

сера является его специфическое местоположение и кратность факторов, участвую-

щих в транскрипции.

Многие энхансеры также содержат специфические сайты для "архитектурных"

белков, которые не имеют функции активации транскрипции, а образуют с энхансе-

ром собственный, скорее стереоспецифический, трехмерный комплекс белка и гена,

который назван энхансеосомой. Эти комплексы нуклеопротеида могут активировать транскрипцию со значительной мощностью и специфичностью за счет взаимодейст-

вия с РНК-полимеразой II.

Факторы транскрипции вириона. В дополнение к энхансерам некоторые ДНК-вирусы кодируют белки, которые упакованы в вирион, вводятся в клетку с ви-

русной ДНК и, затем, облегчают транскрипцию ранних генов. Классическим приме-

ром этого являются поксвирусы, которые реплицируются в цитоплазме, что делает бесполезным клеточный аппарат транскрипции. Поксвирусы кодируют и упаковы-

вают в вирионы собственную РНК-полимеразу, ферменты кэппирования и полиаде-

нилирования и факторы транскрипции. После проникновения в клетку и раздевания,

вирусный транскрипционный аппарат активируется и синтезирует вирусные ранние транскрипты. Другой примером является трансактиватор VP16 вируса простого гер-

песа (HSV). HSV VP16 синтезируется на поздней стадии инфекции и упаковывается в часть вириона, известную как тегумент, который находится между капсидом и оболочкой. После проникновения HSV в клетку, VP16 транспортируется в ядро, где формирует комплекс, по крайней мере, с двумя клеточными белками – Oct-1, кото-

рый является активатором транскрипции, узнающим 8 п.н. последовательность ДНК, и HCF-1. Этот трехмерный комплекс связывается со специфической ДНК-

последовательностью HSV в области TAATGARAT (R = пурин), расположенной

98

выше ранних генов. Специфичность и аффинное сродство обеспечивает Oct-1. Ком-

плекс служит мощным активатором транскрипции. Эта функция связана с С- терми-

нальным активационным доменом VP16, который может связываться фактически с любой последовательностью ДНК, расположенной выше TATA-бокса промотора, в

связи с чем, он может активизировать транскрипцию в любой клетке эукариот. Дей-

ствительно, VP16 является универсальным активатором транскрипции, т.к. актива-

ционный домен VP16 может взаимодействовать со многими различными белками клеточного аппарата транскрипции, однако не ясно, какой именно белок наиболее важен для его действия.

Стимуляция генной экспрессии вирусными ранними белками. В процессе внутриклеточного жизненного цикла ДНК-содержащие вирусы экспрессируют свои гены в высоко упорядоченной последовательности. Хотя экспрессия геномов виру-

сов может регулироваться посттранскрипционно, главный контроль осуществляется на уровне транскрипции. Вирусные ранние гены кодируют белки, которые, будучи транслированы, стимулируют экспрессию так называемых поздних вирусных генов.

Это происходит благодаря наличию ранних и поздних промоторов, которые обычно испытывают недостаток энхансеров или специфических сайтов для комплексо транскрипции, подобных тем, что формируются белками вириона или, например, VP16, для того, чтобы эффективно конкурировать с клеточными промоторами транскрипции. Выражение некоторых вирусных генов (например, поздних генов па-

пиломавирусов) ограничено специфическим состоянием клеточной дифференциров-

ки. В основе этого ограничения может лежать ткане-специфическая экспрессия кле-

точных факторов транскрипции.

Должно также быть отмечено, что несколько вирусов кодируют белки, кото-

рые дополнительно стимулируют экспрессию некоторых вирусных генов в специ-

фическое время жизненного цикла вируса. Кроме того, многие вирусы влияют на экспрессию клеточных генов, что может повлечь за собой индукцию или репрессию специфических генов, а также неспецифическое выключение экспрессии генов.

Имеется много механизмов, которые связаны с функцией ранних вирусных белков.

Например, белок BZLF1 (также известный, как Zta) вируса Эпштейна-Барр (сем. 99

Herpesviridae), может вести себя подобно клеточным факторам транскрипции, кото-

рые связываются со специфической последовательностью выше генов и активизи-

руют их транскрипцию.

Другие ранние белки увеличивают активность клеточных факторов транс-

крипции. Например, белок аденовируса E1A замещает членов транскрипции, разру-

шает комплекс белков семейства E2F и белков-репрессоров семейства Rb. Это уве-

личивает транскрипцию ранних генов аденовируса, которые содержат E2F-

связывающие сайты, что имеет важные последствия для клеточной транскрипции и,

косвенно, для репликации вирусной и клеточной ДНК. Другие ранние белки, подоб-

ные ICP4 вируса простого герпеса, могут стимулировать транскрипцию путем пря-

мого взаимодействия с транскрипционным аппаратом без связывания со специфиче-

скими последовательностями ДНК целевого промотора, или стимулировать экс-

прессию вирусных генов с использованием механизмов посттранскрипционного процессинга. В любом случае результатом действий этих вирусных белков является то, что клеточный транскрипционный аппарат используется для реализации инфор-

мационных программ вируса, а не клетки.

Принципы транскрипции ДНК-геномов. По механизму транскрипции ДНК-

геномы вирусов можно разделить на 4 группы:

1 днДНК, транскрипцию которой осуществляют клеточные ферменты(ядер-

ные полиома-, адено-, герпесвирусы, ряд бактериофагов, например λ, Т4). Как пра-

вило, транскрипцию осуществляет РНК-полимераза II, реже – РНК-полимераза III

(ряд транскриптов аденовируса). Возможны ситуации, когда транскрипцию ранних генов осуществляет клеточная РНК-полимераза, а поздних – вирусоспецифическая или модифицированная клеточная РНК-полимераза, содержащая вирусоспецифиче-

скую субъединицу (фаги Т7 и Т4, соответственно).

днДНК мРНК

2 днДНК, раннюю транскрипцию которой осуществляют вирусные полимера-

зы, входящие в состав вириона. Поздние гены транскрибируются вновь синтезиро-

ванными вирусными полимеразами, детерминированными геномом вируса (поксви100