2.1. Взяття і підготовка матеріалів

Для виділення збудника хвороби Ауєскі використовують головний мозок, шматочки легенів, селезінки, печінки і інших паренхіматозних органів, отриманих при розтині загиблих тварин. За життя хворих свиней вірус можна виділити з секретів носових порожнин, в яких він з'являється на 4—6-й день хвороби і зберігається протягом 5— 11 днів після одужання.

При зборі матеріалів для вірусологічного дослідження слід пам'ятати про нерівномірний розподіл вірусу в різних ділянках мозку. Тому, щоб уникнути помилок при постановці діагнозу, слід брати мінімум по 2—3 фрагменти із різних ділянок мозку, розташованих на деякій відстані один від одного. Зазвичай при розтині відбирають фрагменти мозочка довгастого мозку, шматочки з різних місць великих півкуль головного мозку.

Всі зібрані матеріали відразу ж занурюють в стерильний 40—50%-ный забуферений розчин гліцерину (рН 7,2—7,4) чи в розчин Хенкса з антибіотиками і поміщають в холодильник при 4° або в термос з льодом.

Секрети носової порожнини збирають стерильними ватними тампонами, які вводять в носові ходи, а потім занурюють в пробірки з розчином Хенкса, що містить антибіотики.

Доставлені в лабораторію матеріали обробляють звичайними методами: готують 10%-ну суспензії, центрифугують при 3000—5000 об/хв протягом 15—30 хвилин. Матеріали, консервовані гліцерином, заздалегідь відмивають від нього.

Для більшої вірогідності виділення вірусу і зменшення кількості досліджуваних зразків шматочки з різних відділів мозку від однієї тварини об'єднують в загальну пробу, яку потім подрібнюють, обробляють і досліджують. Для кращого зберігання вірусу в суспензії до неї можна додати 1—2% нормальної інактивованої сироватки крові телят.

Всі матеріали, особливо суспензії тканини легені, перевіряють на бактерійну забрудненість. До використання їх краще зберігати в замороженому стані (мінус 30°) чи при 4° [3].

2.2. Зараження тварин

Як лабораторна модель для виділення вірусу Ауєскі з патологічних матеріалів зазвичай використовують дорослих кроликів, яким внутрішньом'язовий чи підшкірно вводять по 1 мл 10%-ної суспензій досліджуваного матеріалу. Інкубаційний період в цьому випадку продовжується 36—18 годин. Іноді він може тривати до 4—6, а в деяких випадках навіть до 12 днів.

Для підтвердження діагнозу проводять додаткові пасажі на кроликах інокуляцією матеріалу в передню камеру ока чи виділення вірусу в культурі фібробластів курячого ембріона або клітин нирки поросяти.

Матеріалом для виділення вірусу від загиблих кроликів служать тканини головного і спинного мозку, а також паренхіматозні органи (легені, печінка).

2.3. Виділення вірусу в культурі клітин

Для виділення вірусу зазвичай використовують первинно-трипсинізовпані культури фібробластів 10-11-денного курячого ембріона, клітин ниркової тканини поросят 3-6-недільного віку або ембріонів свиней, кроленят 2—20-денного віку. Високочутливі до вірусу субкультури першого пасажу клітин нирки поросяти або великої рогатої худоби.

Культури клітин отримують загальноприйнятими методами. При приготуванні фібробластів курячого ембріона трипсинізують цілісні ембріони, концентрацію клітин в суспензії доводять до 2Х10⁶ клітин в 1 мл, використовуючи в якості ростового середовища 0,5%-вий гідролізат лактальбуміну на розчині Хенкса з 2% сироватки крові великої рогатої худоби. При такій концентрації клітин суцільний моношар формується через 24—48 годин, після чого культура готова для зараження.

Як підтримуюче середовище використовують 0,5%-ный гідролізат лактальбуміну на розчині Ерла (рН 7,4—7,6) з 2% нормальної сироватки крові теляти або ягняти, або зовсім без сироватки.

На випробування кожного матеріалу беруть по 4—6 пробірок з культурою. Доза зараження — 0,2 мл. Адсорбція — 1 година при 37°⁰. Після адсорбції в кожну пробірку додають 0,8—1 мл підтримуючого середовища і поміщають їх в термостат при 37°. При первинному виділенні вірусу з патологічного матеріалу краще поміщати пробірки в барабан, що обертається, що сприяє скороченню термінів появи цитопатогенної дії.

Для виявлення цитопатогенної дії пробірки па протязі 5 днів щодня переглядають під мікроскопом. За відсутності цитопатичних змін на 5-й день культури піддають одноразовому заморожуванню і відтаванню, після чого вносять по 0.2 мл культуральної рідини в декілька пробірок з свіжою культурою. Кожен матеріал страхують 3—5 разів. Для ідентифікації виділеного в культурі вірусу заражають кроликів, у яких при наявності в культуральній рідині віруса Ауєскі розвивається типова картина хвороби.