2.3. Методи флуоресціюючих антитіл.

Метод флуоресціюючих антитіл для діагностики сказу запропонований порівняно недавно і широкого практичного вживання доки не отримав. Проте цей метод високочутливий, специфічний і по результатах збігається з біологічною пробою. Він дозволяє отримати відповідь в день дослідження матеріалу і може замінити біопробу. Метод флуоресціюючих антитіл заснований на мікроскопії специфічно оброблених тканин антирабічною сироваткою, що «мітиться» флуоресціюючими фарбниками.

Застосовують прямий іммунофлуоресцентний метод, непрямий іммунофлуоресцентний метод, коли флуорохромом мітять глобуліни, що містять антитіла до антитіл, і метод забарвлення флуорохромом комплементу. Принцип останнього методу полягає в тому, що на мазок або зрізи, що містять антиген, напластовують комплемент (свіжу сироватку крові морських свинок), а потім мічені флуорохромом антитіла.

При використанні методу флуоресценції забарвлені структури відповідають тільцям Бабеша-Негрі. Даний метод придатний і для виявлення вірусу в слинних залозах хворих тварин. Для приготування мазків-відбитків можна використовувати як свіжу тканину залози, так і що зберігається в гліцерині (ретельно відмивають від останнього), і навіть тканини, розтерті в порошок. Жовто-зелена флуоресценція антигена видно досить виразно, не дивлячись на присутність великої кількості аутофлуоресціруючого матеріалу.

Техніка приготування флуоресціюючих антитіл і використання їх для виявлення антигена полягає в наступному. Антирабічний гамма-глобулін коньюгує з фарбником. Як флуорохром найширше застосовують ізотиоціонат-флуоресцин з максимумом на 550 ммк. Обоє інгредієнта розводять в суміші фосфатного буфера (рН 7,3) з фізіологічним розчином з розрахунку 6-8 міліграм ізоціоната-флуоресцеіну на 1 г білка. Кон'югацію проводять на холоді протягом 16-18 годин при постійному перемішуванні. Отримані конъюгат очищають на колонці за допомогою сефадекса, а потім обробляють однократно порошком з печінки і мозку миші для зниження неспецифічної флуоресценції. Оброблений таким чином матеріал використовують для забарвлення препаратів з подальшим дослідженням під люмінесцентним мікроскопом.

Метод флуоресціюючих антитіл дозволяє отримати відповідь вже через чотири дні. Він по своїй чутливості не поступається біопробі. Автори використовують прямий метод забарвлення аитирабичним кінським гамма-глобуліном з високим титром антитіл, коньюгованих ізоціонатом-флуоресцеіном з розрахунку 1-2 міліграми флуорохрома на 100 міліграм білка.

При прямому методі імунофлуоресценції препарати можна обробляти комерційним аитирабичним кінським гамма глобуліном, коньюгованим флуорохромом по загальноприйнятій методиці. При непрямому методі препарати спочатку обробляють тим же, але не маркірованим гамма-глобуліном, а потім маркірованим антикінським гамма-глобуліном, отриманим імунізацією півнів або кроликів нормальною кінською сироваткою або приготованим з неї гамма-глобуліном.

При люмінесцентній мікроскопії нормальна тканина мозку флуоресціює тьмяним темнуватим світлом. Антиген вірусу сказу виявляється в препаратах у вигляді яскравих жовтувато-зелених або зелених гранул різної форми і величини - від ледве помітних до тих, що мають 15-20 мкм в діаметрі. Залежно від вигляду препарату антиген розташовується в протоплазмі клітин (гістологічні зрізи, відбитки) або вільно, серед тьмяно флюрисціюючого детриту тканини (мазки-відбитки). Специфічність виявленої флуоресценції перевіряють введенням відповідних контролів [5].