1. Упражнение 1. Изучение динамики распределения ионов

Цель работы: установить наличие активного транспорта ионов через кожу лягушки.

Ход работы:

Перед началом опыта берут по 50 мл раствора NaCl и KCl и сливают в стаканчик. Затем определяют содержание ионов Na⁺ и К⁺ в растворе. Этим же раствором заливают обе половины камеры. Дальнейший анализ проводят через 5, 10, 15 и 20 мин. После каждого определения записывают показания прибора для ионов Na⁺ и К⁺. Для каждого отрезка времени рассчитывают разность потенциалов между внешней и внутренней поверхностью кожи (для определяемых ионов). Необходимо построить график изменения величины потенциала от длительности инкубации кожи лягушки.

Упражнение 2. Влияние ингибиторов и блокаторов на проницаемость кожи лягушки

Убедившись в изменении концентрации определенных ионов в растворе, необходимо выяснить их природу на препарате кожи. Порядок работы тот же, что и в предыдущем упражнении, с той лишь разницей, что в исследуемый раствор добавляют 1 мл ингибитора АТФ-азы (строфантин, оуабаин или блокатор SH-групп).

Рассчитать разность потенциалов между наружной и внутренней мембранами можно по следующей формуле:

Е=,

где Е – мембранный потенциал, мВ; R – газовая постоянная; R=8.31Дж/моль·К; Т – абсолютная температура, К(Т=t⁰С+273); F – число Фарадея; F=96485 Кл/моль; Na_е – концентрация ионов Na вне клетки (на наружной стороне кожи); Na_i – концентрация ионов Na внутри клетки (на внутренней стороне кожи).

Сделать выводы о проницаемости кожи лягушки в зависимости от условий опыта.

Контрольные вопросы:

1. Опишите строение клеточной мембраны.

2.Охарактеризуйте транспорт веществ в клетке.

3. Что такое первично-активный и вторично-активный транспорт веществ?

4.Структура и функции Na-, K-АТФ-азы.

5. Назовите ингибитора Na-, K-АТФ-азы.

Литература:

1. Верхотуров В.Н., Рубин А.Б. Автоматизация биофизических исследований: Учеб. пособие. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1988. – 200 с.

2. Костюк П.Г., Гродзинский Д.М., Зима В.Л. Биофизика. Киев: Высш.школа, 1974. – 386 с.

3. Биофизика: Учеб./В.В. Ревин, Г.В. Максимов, О.Р. Кольс. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2002. – 156 с.

4. Рубин А.Б. Биофизика: в 2 т., учеб. для вузов. 2-е изд., испр. И доп. М.: Книжный дом «Университет», 2000. – 486 с.

5. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика: Учеб. пособие. Воронеж: Изд-во Воронеж. Ун-та, 1994. – 336 с.

6. Тарусов Б.Н., Кольс О.Р. Биофизика. Москва: изд-во «Высшая школа», 1968. – 468 с.

7. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. М.: Медицина, 1998. – 704 с.

8. Джаксон М.Б. Молекулярная и клеточная биофизика. М.: Мир, Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 551 с.

Лабораторная работа № 7 Изучение электропроводности крови и эритроцитов

Сопротивление вещества электрическому току определяют методом электропроводности. Это сопротивление будет зависеть от состава вещества и его структуры. Величину электрического сопротивления вещества находят количеством зарядов, способных к передвижению или смещению. Если через проводник, имеющий свободные электроны, пропускать электрический ток, то электроны приобретут среднюю скорость, пропорциональную напряженности поля, и будут двигаться в направлении, противоположном направлению поля. Под влиянием электрического поля устанавливается непрерывное движение электронов, обеспечивающее прохождение электрического тока через проводник. Удельная электропроводность вещества будет зависеть от числа электронов, их заряда и подвижности свободных электронов:

,

где λ – удельная проводимость; n – число электронов; e – заряд; u – подвижность.

В электрических проводниках перенос электричества обеспечивается движением ионов: анионы движутся к аноду (положительный полюс), катионы – к катоду (отрицательный полюс). Удельная электропроводность вещества, имеющего электрическую проводимость, будет обуславливаться количеством ионов, зарядом и скоростью движения ионов. Так, удельная электропроводность бинарного электролита будет равна

λ = ne (U + V),

где n – количество ионов; e – заряд; U, V – скорость катиона и аниона. Поскольку , где а – скорость электролитической диссоциации; с – концентрация электролита; г-экв; N – число Авогадро, то

Так как ионы имеют различные заряды, передвигаются в определенной среде и вступают во взаимодействие друг с другом и с молекулами растворителя, то скорость передвижения будет зависеть и от этих факторов. Проводимость среды определяется диэлектрической постоянной растворителя, вязкостью, температурой, давлением, силами линейного притяжения и отталкивания и образованием ионной атмосферы. Подвижность ионов уменьшится за счет электрической силы релаксации, асимметрии ионной атмосферы и электрофоретического эффекта. Влияние перечисленных выше сил детально разработано Л.Дебаем, В.Хюккелем, Л.Онзагером, которые установили ряд закономерностей и предложили уравнения, описывающие эти закономерности. Названные механизмы проведения электрического тока через вещество характерны как для хороших, так и для плохих проводников.

В плохо проводящих веществах, или полупроводниках и диэлектриках (кроме очень небольшого количества способных к перемещению зарядов), обеспечивающих малую сквозную проводимость тока, имеется известное количество фиксированных зарядов, обусловливающих токи смещения.

Выявить механизм проведения поможет анализ основных закономерностей проведения электрического тока через живое вещество. В начале XIX в. появились первые представления о закономерностях прохождения электрического тока. Было установлено, что живые ткани обладают большим сопротивлением электрическому току, обнаружено возникновение в тканях электрической поляризации, т.е. вторичной электродвижущей силы обратного знака под влиянием электрического тока. Прохождение электрического тока через ткани можно определить по формуле

,

где I – сила тока; E – напряжение; E₁ – вторичная электродвижущая сила; R – сопротивление.

Как известно, электропроводность (способность пропускать электрический ток) – величина, обратная сопротивлению проводника

. Сопротивление выражается формулой R=, где - удельное сопротивление; l – длина проводника; S – сечение проводника. Для выражения электропроводности формула будет иметь следующий вид: ·, где - удельная электропроводность, обозначаемая буквой Н (Ом^-1·см^-1).

. (1.12)

Возникновение вторичной электродвижущей силы создает впечатление, что для живых тканей закон Ома не соблюдается. Однако если вычесть величину вторичной электродвижущей: силы из величины приложенного напряжения, то он окажется вполне применим.

Уменьшение силы тока при прохождении его через ткань можно принять за следствие увеличения сопротивления. В действительности же происходит снижение напряжения вследствие возникновения вторичной (обратной) электродвижущей силы, т.е. поляризации. Поэтому поляризация, возникающая при прохождении электрического тока через ткань, препятствует определению истинного сопротивления этой ткани.

Кроме поляризационной емкости в тканях существует и статическая, обусловленная наличием в живой ткани плохо проводящих частей клетки. Она незначительна и почти не меняется при изменении физиологического состояния ткани. Поляризационная же емкость достигает больших размеров и зависит от физиологического состояния ткани.

Поляризационная емкость представляет собой конденсатор, заряжающийся при прохождении тока через живую ткань. Сопротивление живой ткани складывается из большого числа омических и емкостных сопротивлений. Суммарное сопротивление ткани называют эффективным сопротивлением, или импедансом. Импеданс обычно включает омическое сопротивление и сопротивление емкости и самоиндукции.

Большинство исследователей, изучающих закономерности проведения электрического тока через живую ткань, связывают возникновение поляризации с наличием в живых клетках и тканях полупроницаемых мембран, по обеим сторонам которых находятся свободные ионы. Предполагается, что клеточная мембрана проницаема для одних ионов и непроницаема для других. Не проходящие через мембрану ионы накапливаются возле нее, что приводит к возникновению заряда – поляризации.

Поляризация возможна не только на поверхности ткани, но и во всей ее толще. Живая ткань, как известно, имеет гетерогенное строение. Одни ее части хорошо проводят ток, другие – плохо, являясь непроводниками – изоляторами. Заряженные частицы, имеющие возможность передвигается, накапливаются у границ плохо проводящих частей клетки, что приводит к возникновению поляризационной емкости. Поляризационная емкость может возникать и в связи со смещением под влиянием электрического поля закрепленных зарядов, т.е. дипольных молекул, а также ионов и электронов, не способных к передвижению и жестко закрепленных в структуре живой клетки.

Имеются и другие точки зрения о закономерностях проведения тока через живую ткань и явлениях поляризации в ней под влиянием электрического тока. Одна из них объясняет проведение электрического тока через живую ткань теорией поляризации диэлектриков, разработанной Вагнером. Согласно этой теории поляризация может возникать в дисперсных системах, в которых величины электропроводности дисперсной фазы и дисперсной среды неодинаковы, а также в сложном диэлектрике с различной электрической проводимостью его слоев. При различной проводимости частей диэлектрика или фаз дисперсной системы происходит избыточное накопление зарядов на границах их разделов. Законы прохождения тока и возникновение поляризации в диэлектриках небиологического происхождения объясняют правила его прохождения в живом объекте. Основные закономерности проведения электрического тока установлены в результате ряда исследований, посвященных этому вопросу. В самых ранних работах была обнаружена и затем многими учеными подтверждена абсолютная величина сопротивления живых клеток и тканей, что позволило отнести живые объекты к типу полупроводников или диэлектриков. Установлено также появление поляризации при прохождении через ткань постоянного тока. При использовании переменного тока поляризация уменьшается с увеличением частоты. Большая или меньшая часть заряженных частиц, способных к движению, или ориентации, в зависимости от частоты успевает повернуться или продвинуться, тем самым, участвуя в проведении тока и накоплении зарядов. На высоких частотах явления поляризации полностью исчезают.

По своей природе различают несколько видов поляризации: электронная, ионная, дипольная, макроструктурная, поверхностная, электролитическая.

Электронная поляризация представляет собой смещение электронов на своих орбитах относительно поло­жительно заряженных ядер в атомах и ионах. Время возникновения электронной поляризации осуществляется за 10^-14- 10^-16 с, после наложения поля.

Ионная поляризация - это смещение иона относительно кристаллической решетки. Вследствие этого возникает дипольный момент с направлением противоположным внешнему полю. Время релаксации ионной поляризации на 2 порядка больше, чем у электронной.

Дипольная (ориентационная) поляризация возникает в веществах, содержащих большое количество полярных групп, они при наложении внешнего электрического поля ориентируются в соответствии с этим полем. Дипольная поляризация имеет большое значение в веществах, молекулы которых обладают большим дипольным моментом. К ним относятся: вода, спирт, белки (за счет ионогенных групп). В растворах дипольная поляризация обусловлена вращением поляризации.

Макроструктурная поляризация возникает вследствие неоднородности электрических свойств ве­щества. Для ее возникновения необходимо наличие слоев с различной электропроводностью. Под действием поля свободные ионы и электроны, имеющиеся в этих неоднородностях перемещаются к границам раздела до мембран. Макроструктурная поляризация – это смещение структурных элементов, которые состоят из большого числа молекул, объединенных в отдельные слои с различной электропроводностью. Время релаксации макроструктурной поляризации лежит в пределах 10^-10 с. Макроструктурная поляризация обычно происходит во всем объеме клеток.

Электролитическая поляризация возникает между электродами, находящимися в растворе электролита за счет перераспределения потенциалопределяющих ионов. Электролитическая поляризация в нормальных, т.е. неповрежденных биологических клетках не встречается.

Поверхностная поляризация происходит на поверхнос­тях, имеющих двойной электрический слой. Действие электрического поля приводит к перераспределению ионов диффузионного слоя и дисперсной фазы.

Абсолютная величина сопротивления живых тканей при определении на разных частотах зависит от частоты. Причем чем больше частота, там меньше величина сопротивления. Это уменьшение сопротивления с возрастанием частоты называется дисперсией сопротивления, или дисперсией электропроводности. Зависит она в основном от уменьшения емкости и поляризационного сопротивления. При измерении на высокой частоте поляризационные явления почти полностью исчезают. Остается лишь омическое сопротивление ткани, которое иногда называют внутренним сопротивлением клетки. Отношение величины сопротивления, измеряемой на низкой частоте с четко выраженной поляризацией, к сопротивлению, определяемому на высокой частоте, может служить мерой поляризации живой ткани. Рядом исследователей это отношение было принято за меру поляризации. Например, Б.Н.Тарусов ввел понятие “коэффициент поляризации К”, который является отношением величин сопротивления, измеренных на частоте 10 кГц, к сопротивлению, найденному на частоте 1 МГц:

.

Этот коэффициент поляризации дает представление о величине поляризации живой клетки и ткани.

Все перечисленные особенности проведения электрического тока характерны лишь для живой ткани. При гибели живого объекта все они постепенно элиминируются: у мертвого объекта почти исчезает поляризация, резко уменьшается дисперсия сопротивления, коэффициент поляризации приближается к 1.

Установлено, что закономерности проведения электрического тока через живой объект изменяются при нарушении физиологического состояния и возникновении патологического процесса. Об этом свидетельствуют исследования изменения электропроводности при оплодотворении яиц, раздражении тканей электрическим током, мышечном сокращении, нервном проведении, при росте растений, воздействии на них светом и т. д. Метод электропроводности находит применение и в клетке, например при изучении процессов воспаления, заболеваний кожи, нервной системы, онкологических и других патологий. Получен ряд данных, позволяющих глубже понять сущность этих процессов.

При биофизических исследованиях метод электропроводности в основном использовался для изучения физико-химической структуры живой клетки и ткани. Характерными особенностями его являются возможности исследования организма, ткани, клетки в состоянии, максимально приближенном к прижизненному (изучение нарушенной структуры живого вещества, возможность числового точного выражения величины сопротивления, поддающегося математической обработке, установление корреляции между величиной сопротивления и жизнедеятельностью ткани).

Цель работы: определить электропроводность цельной крови, отдельных фракций и гемолизированной крови. Рассчитать сопротивление цельной крови и отдельных фракций.

Приборы и оборудование:

осциллотитратор ОК-302 для определения электропроводности, центрифуга, камера для регистрации электропроводности крови, шприц, центрифужные пробирки, пипетки, камера для облучения крови.

Материал для исследования и посуда: кровь человека, стаканчики на 100 мл, раствор метиленовой смеси.