5. Анализ продуктов.
Практически в любом биохимическом исследовании очень важно уметь обнаруживать и точно определять ничтожные количества специфических соединений. Чаще всего для этого используют особые индикаторы, которые при взаимодействии со специфическими соединениями определенным образом окрашиваются. Например, для выявления на хроматограмме аминокислот или пептидов хроматограмму опрыскивают нингидрином. Если выявляемый белок находится в растворе, то по интенсивности окрашивания биуретовой реакции можно определить его количество. Фенолы и концентрированная серная кислота окрашивает сахара и в растворе и на хроматограмме в красный цвет. Восстанавливающие сахара выявляют по реакции с раствором нитрата серебра.
Нуклеотиды определяют количественно по их спектрам поглощения. Еще более чувствительным методом является флуоресцентный анализ. Один из новых реагентов, флуорескамин, взаимодействует с любым первичным амином, образуя интенсивно флуоресцирующие продукты.
флуорескамин флуоресцирующее соединение
Чрезвычайно чувствительны методы обнаружения летучих соединений с помощью газовой хроматографии. Применяя пламенные ионизационные детекторы, можно определить содержание практически любого соединения в количестве, не превышающем несколько пикомолей.
Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумажной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную химическую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направлении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по отношению к ней.
6. Определение молекулярной массы.
Наиболее надежные результаты определения молекулярной массы дает ультрацентрифугирование. Основы метода заключаются в следующем. Частицы в растворе осаждаются (седиментация), когда их плотность выше плотности раствора, или всплывают (флотация), когда их плотность ниже плотности раствора. Чем больше разница в плотности, тем быстрее идет распределение частиц. Когда плотности частиц и раствора одинаковые (изопикнические условия), частицы остаются неподвижными. При малой разнице в плотности частицы можно разделить только в центрифуге, которая создает центробежную силу, во много раз превышающую силу земного притяжения.
Величины ускорения до 10 000 g получают с помощью простой настольной центрифуги, высокоскоростные центрифуги с охлаждением позволяют достигнуть 50 000 g, а ультрацентрифуги, работающие с охлаждением и в вакууме, – 500 000 g. Существуют два типа роторов – угловые и свободно подвешенные (бакет-роторы). Последние используются обычно в высокоскоростных центрифугах и ультрацентрифугах..
Скорость седементации частицы зависит от угловой скорости, эффективного радиуса ротора и седиментационных свойств частицы. Седиментационные свойства частицы характеризуются коэффициентом седиментации S и выражаются в единицах Сведберга, коэффициент седиментации может колебаться в широких пределах (от 5 для рРНК до 107 для клеточных ядер).
g=ω2r v= ω2rS S=M(1-ūρ)/f,
где g – ускорение свободного падения (9,81 м/с2),
v – скорость седиментации, см/с,
ω – угловая скорость, рад/с,
S – коэффициент седиментации (1S=10-13 с),
М – молекулярная масса,
ū – парциальный объем частицы, см3/г,
ρ – плотность раствора, г/см3,
f – коэффициент трения.
Наиболее часто ультрацентрифугированием определяют молекулярную массу белка. Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развиваемой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через определенные промежутки времени и определять скорость оседания частиц. Определение молекулярной массы ведут двумя способами – по скорости седиментации белков и по седиментационному равновесию.
В первом случае измеряют скорость перемещения в ячейке ультрацентрифуги границы растворитель-белок, относя ее к величине развиваемого центробежного ускорения, то есть находят константу седиментации S=v/ω2r. Молекулярную массу белка рассчитывают по формуле M=RTS/D(1-ρ/σ), где R – газовая постоянная, T – температура, D – коэффициент диффузии, ρ – плотность растворителя, σ – плотность белковых частиц. Во втором случае измеряют концентрацию белка с1 и с2 в двух точках ячейки на расстоянии х1 и х2 от центра ротора в тот момент, когда после определенного срока работы ультрацентрифуги я ячейке установится седиментационное равновесие. Расчет ведут по формуле
M=2RT ln(c2/c1)/(1-ρ/σ)ω2(x22-x12).
При изопикническом центрифугировании пробу (ДНК, РНК или вирусы) равномерно распределяют во всем объеме раствора CsCl. Градиент плотности создается в процессе центрифугирования за счет седиментации и диффузии. Со временем каждая частица попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование прекращают, когда устанавливается равновесие. При использовании коротких кювет седиментационное равновесие достигается за несколько часов.
Кроме ультрацентрифугирования молекулярный вес белков определяют простой гель-фильтрацией. Определяют объем элюента, необходимого для выноса белка из колонки с гелем сефадекса Ve, и соотнесении его со свободным объемом колонки Vo. Пользуясь калибровочным графиком, построенным по Ve/Vo с использованием маркерного белка, находят молекулярную массу исследуемого белка.