26

ЛЕКЦИЯ №11

Методы изучения структуры молекул

Клетки значительно отличаются друг от друга. Некоторые специализированные клетки накапливают в большом количестве триацилглицериды или углеводы. Железистые клетки часто характеризуются необычно высоким содержанием белка и РНК. Простой приближенный анализ состава ткани проводят следующим образом. Ткань полностью высушивают в вакууме при низкой температуре (лиофилизация) и из полученного твердого материала соответствующими растворителями экстрагируют липиды. После выпаривания растворителя взвешивают оставшиеся липиды. Содержание белка часто оценивают по содержанию азота, умножив его количество на 6,25 (так как процентное содержание азота в белке достаточно стабильная величина и равна 16%, то есть 100:16=6,25). Мерой содержания в ткани неорганических компонентов служит вес золы, образовавшейся после сжигания образца ткани при высокой температуре. В рамках такого приближенного анализа содержание углеводов оценивается вычитанием всего остального из 100%.

В современной биохимии важное место занимает разделение соединений, анализ смесей и установление структуры молекул. Стадии изучения структур молекул:

1. Выделение.

А. Фракционирование клеток.

Исходным материалом при фракционировании может служить свежая ткань (растительная или животная) или осадок спрессованных клеток микроорганизма, обычно получаемый с помощью центрифугирования.

Ткань измельчают. Легче всего разрушаются клетки животных, сложнее клетки растений, обладающие клеточной стенкой, еще проблематичнее разрушить микробные клетки. Чтобы избежать денатурации белка в процессе его выделения, все операции проводят в мягких условиях – при низкой температуре (не выше 5^оС), избегая действия разных химических агентов. Животные клетки разрушают гомогенизаторами. Клеточные стенки растений и микроорганизмов разрушают мельницами, специальными гомогенизаторами, путем продавливания через фильтры специального пресса, методом попеременного замораживания и оттаивания, ультразвуком. Также используют метод «азотной бомбы», который заключается в насыщении суспендированных клеток газообразным азотом под высоким давлением, которое затем резко сбрасывают, – азот, проникший внутрь клеток, выделяется в виде газа и взрывает их. При фракционировании очень важно подобрать значение рН и состав буфера, а при выделении субклеточных органелл – осмотическое давление. Для сохранения целостности органелл часто в качестве среды используют 0,25 М сахарозу, к которой добавляют MgCl₂, а также реагент, образующий комплекс с металлами, например этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Растворимые ферменты обычно экстрагируют без добавления сахарозы, но при этом используют восстановители – глутатион, меркаптоэтанол или дитиотреитол.

Полученный сырой гомогенат процеживают и обычно центрифугируют непродолжительное время, чтобы удалить фрагменты клеток. Клеточные органеллы, как правило, отделяют центрифугированием. Одна из методик состоит в следующем. Гомогенат в 0,25 М сахарозе (изотоничной по отношению к большей части клеток) центрифугируют в течение 10 мин при 600-1000 g, что позволяет осадить ядра и целые клетки. Затем надосадочную жидкость центрифугируют еще 10 мин при 10 000 g, в результате чего осаждаются митохондрии и лизосомы. Наконец, центрифугирование в течение часа при 100 000 g дает микросомный осадок. Супернатант (надосадочная жидкость), остающийся после центрифугирования с максимальной скоростью, служит исходным материалом для выделения растворимых ферментов и многих низкомолекулярных соединений.

Для выделения интактных органелл среда должна быть изотоничной, в гипотоничной среде органеллы будут впитывать воду и лопнут, а в гипертонических растворах они сморщатся. Выделение органелл проводят при низких температурах (0-5⁰С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счет реакций, катализируемых ферментами, которые высвобождаются в процессе разрушения тканей. Часто добавляют тиолы и хелатирующие агенты для защиты функциональных SH-групп от окисления.

Б. Разделение, основанное на разной растворимости компонентов системы.

Фибриллярные белки практически нерастворимы в воде, поэтому все остальные компоненты материала можно удалить растворением. Растворимость белка сильно зависит от концентрации солей, то есть от ионной силы раствора. В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы: μ=1/2Σсz², где μ – ионная сила раствора, с – молярная концентрация, z – заряд иона. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации. При высокой ионной силе ионы солей забирают гидратную оболочку у молекул белка, что приводит к агрегации и выпадению белков в осадок (явление высаливания). Растворимость белков при этом связана с ионной силой раствора следующим уравнением: lgS=β’ - K_sμ, где S – растворимость, г/л, β’ – растворимость белка в гипотетическом растворе при ионной силе, равной нулю, K_s – константа высаливания. Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей разделить смесь белков.

Извлечение белков из гомогената чаще всего проводят 8-10% солевыми растворами. Наиболее пригодные для экстрагирования ионы представлены в следующих рядах:

Li⁺ > K⁺ > Na⁺ P₂O₇⁴⁺ > B₄O₇^2- > PO₄^3- > CNS^- > HCO₃^- > I^- > Cl^-

Извлечению белков из биологических мембран способствует их обработка детергентами (додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия, триалкиламмониопропансульфонатами, алкилгликозидами и тритоном Х-100). Они ослабляют гидрофобные белково-липидные и белок-белковые взаимодействия, результатом чего является деструкция биологических мембран и высвобождение из них структурных и функциональных белковых компонентов.

При выделении белков из растительных тканей используют специфические методы: обработку тканей водноэфирной смесью, резко повышающей проницаемость оболочки растительной клетки (метод Чибнелла), или экстракцию белков смесью фенола, уксусной кислоты и воды (метод Синджа).

Растворимые белки чаще всего осаждают из водных растворов методом высаливания. Метод основан на свойстве каждого отдельного белка разделяемой смеси осаждаться из нее при определенной концентрации той или иной соли (чаще всего используют сульфат аммония), в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Высаливание широко используется как первый шаг очистки, так как позволяют получать сразу большие количества материала.

Можно высаливать белки с использованием органических растворителей – метилового и этилового спирта. Например, можно разделить белки плазмы крови при температуре -5^оС:

- рН 7,2, спирт 8% - фибриноген;

- рН 6,9, спирт 25% - β и γ-глобулины;

- рН 5,8, спирт 40% - α-глобулины;

- рН 4,8, спирт 40% - альбумины.

РНК чаще всего получают экстракцией, обрабатывая препарат фенолом, насыщенным водой, в котором осаждаются все белки и остаются в водном слое полисахариды. При определенных условиях иногда удается удалить и ДНК. Нуклеиновые кислоты можно отделить от белков, удаляя последние с помощью протеолитических ферментов.

Некоторые углеводы, например целлюлоза и гликоген, устойчивы к кипячению в щелочи, и это позволяет удалить все другие компоненты смеси.

Липиды экстрагируют из тканей неполярными растворителями, например смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1.

В. Разделение, основанное на распределении соединений между разными фазами.

Многие наиболее важные методы разделения основаны на распределительной хроматографии – на многократном распределении соединений между двумя разными фазами, из которых хотя бы одна обычно является жидкой. Если на инертный носитель нанести малополярную неподвижную фазу, а затем смесь неполярных веществ, то они будут удерживаться носителем за счет гидрофобного взаимодействия. Если такую колонку промыть смесью полярных растворителей (подвижной фазой), то компоненты смеси будут перемещаться с различной скоростью в зависимости от их полярности. Вначале будут элюировать гидрофильные вещества, слабо взаимодействующие с неподвижной фазой, а затем гидрофобные вещества. Приведенное выше описание соответствует современной модификации метода, называемой обращенно-фазовой хроматографией. В первых вариантах распределительной хроматографии гидрофильной была неподвижная фаза, а гидрофобной – подвижная.

Адсорбционная хроматография в качестве одной из фаз использует порошок окиси алюминия или другие адсорбенты, которыми заполняют вертикальную колонку. Пигменты растворяют в неполярных растворителях (например, гексане), пропускают через колонку, где смесь разделяется на окрашенные полосы. Непрерывно пропуская растворитель через колонку, можно элюировать отдельные пигменты в чистом виде. Пигменты не растворяются в твердой фазе, а адсорбируются на его поверхности.

Часто в качестве материала, которым заполняют колонки, используют силикагель, содержащий большое количество воды. Разделение компонентов в этом случае происходит за счет их распределения между водной фазой, иммобилизированной силикагелем, и водой, протекающей через колонку.

Для разделения липидов применяют колонки с обращенной фазой. Их наполняют силикагелем, окисью алюминия или другим инертным материалом, пропитанным неполярной жидкостью. В роли подвижной фазы в этом случае выступает более полярный растворитель.

Хроматография на бумаге основана на использовании в качестве иммобилизированной фазы высококачественной фильтровальной бумаги, адсорбирующей воду. Применяют для разделения аминокислот и других растворимых в воде соединений.

В последнее время вместо бумажной хроматографии широкое распространение получила тонкослойная хроматография – вместо бумаги здесь используют тонкий слой силикагеля, нанесенный на стеклянную пластинку. Этот метод дает более быстрое и качественное разделение. ТСХ является эффективным и быстрым методом разделения липидов. Исследуемый образец наносят на тонкий слой силикагеля, закрепленный на пластинке. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с небольшим количеством растворителя. Под действием капиллярных сил фронт растворителя продвигается по пластинке, увлекая вещества, присутствующие в образце. Когда растворитель достигает верхнего края пластинки, слой силикагеля высушивают и проявляют с помощью красителей или в УФ-свете. Подвижность вещества в данной системе выражают в виде величины R_f – отношению расстоянию пробега вещества к расстоянию пробега растворителя. Сравнивая полученные значения R_f с подвижностью контрольных веществ, идентифицируют соединения, присутствующие в образце.

Для разделения летучих веществ применяется газовая хроматография, основанная на установлении динамического равновесия между газовой и неподвижной фазами при сравнительно высоких температурах. Область применения этого метода расширяется в связи с возможностью образования летучих производных разделяемых соединений, например метиловых эфиров или триметилсилильных производных сахаров.

Весьма важное место принадлежит аффинной хроматографии. Она основана на использовании особых адсорбентов, специфически взаимодействующих с макромолекулами и избирательно удерживающих данный вид макромолекул. Примером может служить адсорбция комплементарных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты на иммобилизированной ДНК. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель или наносят на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с адсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров, свободно проходят дальше. Аффинная хроматография используется также для очистки ферментов, антител и других белков, способных прочно связываться со специфическими малыми молекулами. Примером применения аффинной хроматографии для очистки ферментов может служить выделение стафилококковой нуклеазы с помощью хроматографии на колонке с агарозой, содержащей следующую группу, комплементарную активному центру фермента:

Важнейшим методом препаративного и аналитического разделения веществ становится высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Ее используют, например, для разделения аминокислот. Сначала при взаимодействии с фенилизотиоцианатом получают производные аминокислот:

Эти конъюгаты малополярны и благодаря поглощению в УФ-области спектра их можно обнаруживать в элюате фотометрически. В качестве неподвижной фазы используются мелкие частицы силикагеля диаметром 5 мкм с привитыми углеводородными цепями. Использование мелкодисперсных носителей позволяет повысить качество распределения, однако при этом растет механическое сопротивление колонки. Поэтому ВЭЖХ проводят в капиллярах или колонках, выполненных из нержавеющей стали, а элюент подают с помощью насосов высокого давления. В качестве элюентов используются системы растворителей с возрастающей концентрацией ацетонитрила CH₃CN. Состав подвижной фазы, а, следовательно, и качество разделения оптимизируют с помощью программируемых градиентных смесителей.

Г. Разделение, основанное на размерах молекул.

Диализ – метод основан на неспособности высокомолекулярных соединений проходить через полупроницаемую мембрану, через которую свободно проходят низкомолекулярные вещества. Раствор белка помещают в диализационный мешочек, а мешочек помещают в сосуд, через который длительно пропускают воду. Полупроницаемая мембрана, окружающая раствор белка, свободно пропускает воду и низкомолекулярные соединения, такие как NaCl или глюкоза, но не пропускает большие молекулы, в частности молекулы белка. Малые молекулы диффундируют из диализного мешочка во внешний сосуд, так как в процессе диффузии молекулы стремятся перейти в зону с более низкой их концентрацией. Заменяя несколько раз водную фазу во внешнем сосуде на дистиллированную воду, можно снизить концентрацию низкомолекулярных соединений в растворе белка до сколь угодно малой величины.

Электродиализ отличается тем, что возле полупроницаемых мембран диализационной камеры помещают электроды, при этом более эффективно происходит очистка от заряженных ионов

Ультрафильтрация – раствор, содержащий крупные молекулы, продавливают через мембрану высокой прочности с калиброванными порами сжатым газом или центробежной силой, часто используют для разделения белков, белок не только задерживается на мембране, но и концентрируется.

Более сложный характер имеет гель-фильтрация. Колонку наполняют материалом типа декстрана с большим числом поперечных сшивок (сефадекс). Обычно он имеет вид спрессованных мягких шариков. Шарик представляет собой трехмерную сеть из углеводных цепей. Пространство между цепями зависит от числа сшивок, образующихся в геле при его химической обработке, оно недостаточно для проникновения туда крупных молекул, но в нем вполне могут задерживаться малые молекулы. При пропускании через такую колонку смеси разных молекул малые молекулы диффундируют внутрь частиц геля и задерживаются там, а крупные проходят беспрепятственно. Сефадекс G-25 не задерживает ничего, кроме низкомолекулярных солей и соединений типа простых циклических сахаров. Сефадекс G-200 с гораздо меньшим числом поперечных сшивок применяется для разделения макромолекул, молекулярная масса которых лежит в интервале 5 000-200 000.

Д. Центрифугирование.

Скорость седиментации молекул в центробежном поле зависит от формы и размеров молекул. Каждая молекула характеризуется своей константой седиментации S, выражаемой в единицах Сведберга. Когда же в центрифуге устанавливается седиментационное равновесие, то главным фактором, определяющим, где в итоге окажутся частицы, становится их плотность.

Чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы от 25% на дне до 5% на поверхности. Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентов сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положение каждой фракции и содержание в ней РНК. ДНК чаще всего разделяют в градиенте CsCl. В плотных солевых растворах градиенты достаточно устойчивы, и для лучшего разделения применяются очень сильные центробежные поля. В результате можно отделить одноцепочечную ДНК от двухцепочечной или разделить препараты ДНК с разным ГЦ-содержанием.

Е. Разделение, основанное на электрическом заряде молекул.

В основе ряда методов разделения молекул лежит различие в суммарном заряде, который они несут при данном рН среды. Этот суммарный заряд для многих соединений легко оценить по числу содержащихся в них кислых и основных групп.

Электрофорез – процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле Скорость передвижения молекул определенного вида к катоду или аноду зависит от электрического заряда, молекулярной массы и формы молекулы, ионной силы, рН и состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Наибольшее распространение получил электрофорез на твердых средах: целлюлозе, ацетилцеллюлозе, агарозе, крахмальном и полиакриламидном геле. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков, наносят в виде тонкой полоски на носитель. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжение устанавливают обычно в несколько сот вольт. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2-3 тыс.вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин; иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду; его называют методом электрофоретического молекулярного сита.

При изоэлектрическом фокусировании в вертикальной колонке между катодом и анодом электрохимически создается градиент рН. Градиент рН стабилизируется градиентом плотности, чаще всего сахарозным; вся система тщательно термостатируется. Белки в колонке движутся в направлении, соответствующем их изоэлектрической точке, где фокусируются в виде очень узкой полосы. Две соседние полосы могут быть разделены интервалом всего лишь в 0,01 единицы рН. Считается, что изоэлектрические точки белков в обычных экспериментальных условиях близки к их изоионным точкам, то есть к тем значениям рН, при которых белки остаются изоэлектрическими в условиях полного отсутствия добавленного электролита.

Важным методом разделения молекул является ионообменная хроматография. Метод основан на электростатическом взаимодействии между ионами противоположного заряда. Главное условие при этом, чтобы ионы одного заряда были ковалентно фиксированы на онертном носителе. Такой ионообменник будет связывать ионы противоположного заряда. Обычно применяются водные растворы смесей и колонки, наполненные ионообменной смолой – пористым веществом, содержащим связанны ионные группы, например –SO₃^-, -COO^-, -NH₃⁺, или четвертичные атомы азота. Для разделения малых молекул берут синтетические смолы, основу которых составляет полистирол с поперечными сшивками. Для крупных молекул больше подходят производные целлюлозы или поперечносшитых декстранов (сефадекс). При промывании ионообменника раствором с более высокой ионной силой или иным значением рН сорбированные ионы можно селективно перевести в раствор (элюировать).

При разделении аминокислот методом ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы синтетического полимера, несущие сульфогруппы –SO₃^-. Эти группы ионизированы во всем диапазоне рН и несут отрицательный заряд. Для подготовки к работе ионообменник помещают в колонку и промывают Na⁺-содержащим буферным раствором с рН 2. При этом сульфогруппа связывает ионы натрия. Если теперь нанести на колонку раствор аминокислот, то положительно заряженные аминокислоты вытеснят ионы натрия и будут сорбироваться на ионите. Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их элюируют с колонки буфером с более высоким значением рН. Из колонки разделенные аминокислоты направляются в смеситель, куда подается раствор нингидрина, далее окрашенный раствор подается в ФЭК, связанный с самописцем, на ленте которого плотность окраски записывается в виде пиков, высота и ширина их соответствуют содержанию аминокислоты в растворе. Все перечисленные устройства образуют прибор, получивший название автоматического анализатора аминокислот.