Организация геномов и особенности репликации т-четных и т-нечетных бактериофагов
Исследованию подверглись нуклеиновые кислот Т-чётных фагов, размеры которых довольно близки к размерам фага λ, попытки обнаружить липкие концы у этих ДНК, этих фагов, оказались неудачными, ДНК фагов Т-4, Т-2 не обладала липкими концами, однако был выявлен другой интересный факт, молекула ДНК данных фагов характеризуется наличием !!!!!!!!!!!!концевых избыточностей.
Эти концевые участки, содержащие несколько одинаковых генов, получили название концевых избыточностей, и что интересно, конкретный геном определённой фаговой частицы отличался от такового другой такой же фаговой частицы, именно характером последовательностей данных концевых избыточностей, хотя в каждом случае эти геномы содержали полный набор необходимых для развития фага генов. Но эти гены располагались не в одинаковой последовательности, хотя сцепленность генов была идентична такая ситуация получила название кольцевой или циклической пермутацией генов.
Так вот молекулы ДНК фага Т-4 характеризуется следующим: эти молекулы содержат набор всех генов, но концевые избыточности (концевые повторы) разные. Это происходит в результате того, что в процессе репродукции фага под действием специфических нуклеаз клетки хозяина, одна из нитей съедается специфической нуклеазой, и формируются комплементарные окончания, эти комплементарные окончания могут спаиваться и формировать !!!!!конкатемеры!!!!!!, т.е. длинные тандемно связанные геномы фагов. Такие конкатемеры при упаковки ДНК в фаговую частицу подвергаются разрезанию, особой ферментной системой, в сайтах соответствующих размеров полного генома, т.е. разрезание происходит не специфично в отношении последовательностей в месте разрезания, а каким-то образом эти ферменты определяют длину нуклеиновой кислоты, которая будет упаковываться в фаговую частицу, и режется конкатемер в разных участках, в результате чего и формируются разные окончания, т.е. разные концевые избыточности. Размеры таких молекул примерно на 2 % больше длины всех генов, когда они упакованы в одну единую структуру.
Начинают образовываться конкатемеры после появления примерно 20 копий геномов вируса, когда проникшая ДНК образует примерно 20 копий. Эти линейные копии могут формировать конкатемеры. Нарезание конкатемеров с упаковкой ДНК в головку обеспечивается особыми нуклеазами, которые режут, либо, отмеряя определенные размер генома, либо в других случаях, эти нуклеазы распознают особые сайты, короткие последовательности, по которым режет конкатемер. В результате этих процессов формируются полноценные геномы бактериофагов.
При изучении достаточно детально механизмов сборки фаговых частиц фага Т4, было установлено, что существует определенное количество неструктурных фаговых белков, которые могут каким-то образом управлять процессом сборки фаговых частиц.
Молекула фаговой ДНК, размеры которой достигают в длину примерно 500 микрометров, в головке находится в тесно конденсированном состоянии, которое толком не охарактеризовано и величина головки составляет не больше 1 микрометра и в этом пространстве упакована достаточно большая молекула ДНК.
Репликация ДНК с использование промежуточных конкатемерных форм
Простейшая схема такой репликации наблюдается у бактериофагов T-нечетной серии, например T7. ДНК фага T7 — линейная двухнитевая молекула с прямыми концевыми повторами. Инициация репликации начинается на внутреннем участке, где расположен промотор для фаговой ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует транскрипт, использующийся в качестве затравки для синтеза ДНК. Внутренняя инициация проходит без разрыва родительской цепи. Возникшие две репликативные вилки движутся в разных направлениях, осуществляя полуконсервативную репликацию вирусного генома. Первая стадия этого процесса заканчивается образованием двух дочерних дуплексов, где вновь синтезированные нити не достроены, так как не произошло копирования 3'-концов родительских цепей, что неизбежно возникает при внутренней инициации на линейной матрице. Таким образом, один из 3'-концов образовавшихся дуплексов находится в однонитевой форме.
Поскольку молекула ДНК фага Т7 имеет прямой концевой повтор, однонитевые 3'-концы сестринских молекул взаимно комплементарны и способны к ассоциации. Ассоциация комплементарных последовательностей приводит к образованию димерных молекул — конкатемеров. Далее созревание молекул идет аналогично рассмотренному нами выше способу терминации. Фагоспецифический фермент вносит в димер ступенчатый разрыв таким образом, что выступающими становятся 5'-концы, которые репарируются ДНК-полимеразой (рис. 6).
Схема репликации ДНК фага T7