20. Очистка бактериофага. Получение чистых линий.

На практике при получении мутантов, генетическом анализе и т. п. часто приходится выделять чистые линии бактериофагов, представляющих собой потомство одной фаговой частицы. Существуют приемы, позволяющие произвести выделение чистых линий бактериофагов с минимальными затратами питательных сред и времени.

Техника получения чистых линий фагов. Смесь Т-четных и Т-нечетных бактериофагов, образующих крупные и мелкие негативные колонии, высевают на газон бактерий Е. coli В. Для этого в полужидкий 0,7%-й расплавленный агар вносят 0,2 мл культуры бактерий, перемешивают и наслаивают в чашки Петри на поверхность 1,5%-го питательного агара. Чашки подсушивают, затем полоски стерильной фильтровальной бумаги обмакивают в смесь бактериофагов и проводят ими параллельные линии по газону бактериальной культуры (сверху вниз, до 10 линий на чашку). Чашки помещают в термостат с температурой 37°С. В местах нанесения фага будут видны зоны лизиса бактериальной культуры, при­чем на первых полосах - более выраженный лизис, а на последних - отдельные негативные колонии фагов. Отмечают две изолированные колонии (крупную и мелкую) и с помощью бактериологической петли переносят каждую вместе с агаром в отдельную пробирку с 1 мл бульона. Из каждой пробирки стерильной бумажной полоской производят рассев фага на газон чувствительных бактерий. Чашки инкубируют при температуре 37 °С. Убеждаются, что после расчистки на каждой чашке формируются негативные колонии одного типа, в противном случае процедуру расчистки повторяют.

Линия фага считается чистой, когда однородные негативные колонии фага образуются на протяжении не менее 5 пассажей.

20. Особенности репликации вируса гепатита в.

Вирионы гепатита В (частицы Дейна) сферической формы с диаметром 42—45 нм. Они состоят из сердцевины диаметром 27 нм, содержащей вирусную двунитчатую кольцевую ДНК, окруженную мембраной толщиной 2 нм; сердцевина окружена внешней липопротеидной оболочкой толщиной 7 нм. Наряду с полноценными вирионами встречаются в гораздо большем количестве частицы, состоящие лишь из фрагментов наружной оболочки. Они могут быть сферическими с диаметром 16—25 нм и нитевидными с диаметром 10—20 нм и длиной до 700 нм. Нитевидные структуры являются агрегатами сферических частиц. Частицы содержат поверхностный антиген вируса — HBs-антиген и накапливаются в результате избыточной продукции поверхностного компонента частиц Дейна. Частицы HBs антигена не обладают инфекционной активностью, однако, они являют­ся маркером на возможное присутствие частиц Дейна в исследуемом материале.

Гепатит В (гепадновирус) - подгруппа ДНК-содержащих вирусов, содержащих двунитевую ДНК.

Геном данного вируса представлен кольцевой молекулой ДНК, которая не является ковалентонозамкнутой молекулой ДНК, а имеется линкер, обеспечивающий закольцовывание. Причём одна из нитей имеет разрывы, т.е. несплошная, и стабилизация всей геномной молекулы обеспечивается второй нитью, которая не имеет разрывов. В составе вирусной частицы вируса гепатита В имеется фермент- ДНК-полимераза, которая обеспечивает достраивание разодранной нити до цельной нити и формирование двунитевой молекулы ДНК, которая транскрибируется с образованием РНК-продуктов двух типов:

• РНК одного класса служит в качестве иРНК для синтеза соответствующих белков;

• РНК второго класса представляет собой своеобразные РНК-матрицы для синтеза геномной ДНК вируса гепатита В. Причём этот синтез геномной ДНК вируса гепатита В на РНК-матрице осуществляется обратной транскриптазой (для чего – не известно).

(вирус гепатита В является предраковым – рак печени).

Геном вируса гепатита В не встраивается в генном клетки и, в отличие от ретровирусов, не проходит стадию интермедиата ДНК в процессе репродукции. Если обнаруживаются в геноме клетки фрагменты генома вируса гепатита В, то эта ситуация является инициирующей для процесса превращения клетки в злокачественную. С этим связана онкогенная функция гепатита В.

Схема репродукции вируса гепатита Б (гепадновирусы)

Родительская геномная ДНК вируса имеет разрывы в одной нити, вторая нить стабилизирует эти структуры. Полимеризующие ферменты вириона на первых этапах репродукции обеспечивают заделывание этих брешей (репарацию) и превращение в двунитевую структуру молекулы ДНК. Эта молекула транскрибируется и возникает 2 класса РНК:

П ервый класс – это «+» иРНК транслируется в белки, среди которых обратная транскриптапза, полимераза, специфическая иРНК(?), которая участвует в репликации ДНК.

РНК второго класса, возникающая при транскрипции ,является матрицей для синтеза с помощью обратной транскриптазы двунитевой геномной ДНК, включающаяся вместе со структурными белками в образование зрелого потомства. В природе существует генно-инженерная вакцина против гепатита В, созданная по технологиям рекомбинатных ДНК. Автор вакцины – сэр Кент Мурей.

Вирус проникает в клетки печени (гепатоциты) благодаря наличию на их поверхности специфических рецепторов, после разрушения наружных оболочек освобождается внутренний компонент, имеющаяся в его составе вирусная ДНК-полимераза достраивает недостающий участок второй нити ДНК. Инфекция может проходить по одному из двух механизмов — продуктивному или интегративному. При продуктивном типе инфекции происходит транскрипция ДНК с помощью клеточных ферментов, образование иРНК, синтез вирусных белков. Репликация ДНК происходит по уникальному способу с использованием в качестве промежуточной формы не ДНК, а РНК. Цикл репродукции оканчивается сборкой вирусных частиц в цитоплазме гепатоцитов с участием мембран ретикулоэндотелиальной системы. При интегративной инфекции после достройки второй нити ДНК происходит интеграция ДНК с клеточным геномом вблизи сильного промотора, возможно, в области альбуминовых генов. В этом случае клетка начинает в огромном избытке производить HBs-антиген.