1. Сырье «Листья», «Цветки», «Травы». Дать определение и привести общие приемы макроскопического и микроскопического анализа лрс. Люминисцентная микроскопия, значение анализа

Листья — Folia. Под термином «листья» в фармации понимают высушенные целые листья или их части, т. е. отдельные листочки сложного листа (лист сенны). Тонкие листья в сырье сморщиваются, их необходимо предварительно размочить, погрузив на несколько минут в горячую воду. Затем листья расправляют при помощи пинцета и иглы, чтобы видны были форма листа, край, жилкование, черешок. Мелкие и кожистые листья не размачивают. Обращают внимание на поверхность листа с обеих строи (голая, или опушенная, жилки вдавлены или выступают). Этот признак лучше рассматривать на сухом сырье. Наличие эфирномасличных железок и других образований на поверхности листа, а также вместилищ в мезофилле определяют с помощью лупы (увеличение 10).

Цветки — Flores. Цветки как сырье включают высушенные соцветия, их части и отдельные цветки. Заготовляют обычно распустившиеся цветки. Корзинки сложноцветных (астровых) собирают в начале цветения трубчатых цветков, некоторые виды сырья — в фазу бутонизации (цветки цитварной полыни). Цветки используют в неизмельченном виде, поэтому для определения подлинности сырья достаточно исследовать внешние признаки. При необходимости сырье рассматривают под микроскопом. Цвет, запах и размеры образца устанавливают на сухом сырье. Для определения строения цветка его размачивают в горячей воде, помещают на предметное стекло и под лупой расчленяют двумя иглами, рассматривая чашечку, венчик, тычинки, пестик.

Трава— Негbа. Травой называют высушенные надземные части травянистых растений, состоящие из листоносных и цветоносных стеблей; в ней присутствуют цветки, а иногда и плоды разной степени развития.

Заготавливают траву по-разному: собирают только верхушки (череда), всю надземную часть, отбрасывая толстые нижние стебли (зверобой), у некоторых трав после обмолота оставляют только цветки и листья (тимьян, чабрец, донник), траву сушеницы топяной вырывают с корнями. В сухих травах определяют длину стебля, диаметр цветка или соцветия, опушенность, цвет, запах; в размоченных травах — форму листа, характер прикрепления листа к стеблю, форму стебля, тип соцветия, строение цветка и тип плода. Форма стебля видна на поперечном разрезе. Листья, цветки и плоды обрывают и измельчают отдельно.

Микроскопический анализ основан на определении признаков анатомического строения и обычно применяется для исследования резаного и порошкообразного лекарственного сырья. Цель микроскопического анализа — установить подлинность сырья.

Препараты для микроскопического анализа готовят из сырья, предварительно просветленного в растворе КОН. Для этого кусочки листовой пластинки (с краем листа, жилкой), венчика и чашечки, иногда стеблей (в безлистном сырье) кипятят в 5%-ном водном растворе КОН 1—2 мин в зависимости от толщины листа, затем содержимое пробирки выливают в чашку, жидкость сливают, сырье промывают и оставляют в юде. Кусочки сырья берут лопаточкой I или препаровальной иглой, если листья тонкие и собираются при вынимании в складочки, подводят предметное стекло в воду под кусочек листа, вынимают его иглой на стекло и расправляют. Если лист надо рассматривать с двух сторон, кусочек листовой пластинки разрывают на две части скальпелем на предметном стекле, одну часть осторожно перевертывают и помещают рядом со второй. Плотные листья при рассмотрении раздавливают лопаточкой или скальпелем. Готовые препараты и срезы просматривают в растворе хлоралгидрата. Иногда при анализе листьев и трав используют микрохимические реакции с раствором Судана III: на эфирное масло, млечники, вместилища со смолой и кутикулу. Если требуется приготовить срез листа, выбирают кусочек, содержащий главную жилку, мелкие листья рассматривают целиком.

Цветки. В качестве лекарственного сырья цветки используют в цельном виде. При их анализе могут играть роль эфирномасличные железки, кристаллы, сосочковидные выросты на эпидерме, волоски и пыльца характерной формы и размеров, иногда механические элементы.

Травы. Основное внимание обращают на признаки листьев, так как травы определяют по листьям. Иногда имеют значение элементы стеблей, цветков, плодов. На стеблях наиболее характерны эпидерма с многоугольными вытянутыми клетками, обрывки крупных прямых сосудов (в отличие от разветвляющихся жилок листа), механические волокна.

Флюориметрический анализ основан на измерении интенсивности люминесценции испытуемых веществ. Это самый чувствительный метод при анализе кумаринов, флавоноидов, антрахинонов. Практически люминесценцию определяют в растворах с концентрацией 10^-5 – 10^-6 моль/л, когда между ее интенсивностью и концентрацией вещества наблюдается прямолинейная зависимость. Для выполнения анализа используют флюориметры или спектрофлюориметры. Метод используется пока ограниченно

2. Понятие о флавоноидах, их классификация. Физические и химические свойства. Закономерности образования (биосинтез), распространение в растениях и локализация в органах растений. Роль для жизни растений. Оценка качества сырья, методы анализа Пути использования, медицинское применение

Флавоноиды — фенольные соединения, в основе которых лежит дифе-нилпропановый скелет С₆—С₃—С₆, составляют большую группу природных соединений, широко распространенных в растительном мире.

Классификация флавоноидов

В основе всех флавоноидов лежит соединение, именуемое флаваном, которое является 2-фенил-хроманом или 2-фенил-бенз-у-пираном.

Флаван

В зависимости от структуры связывающего трехуглеродного звена, а также степени его окисленнсти, все флавоноиды разделяются на следующие основные группы.

Катехины (флаван-3-олы). Бесцветные соединения, которые, являясь наиболее восстановленными флавоноидными соединениями, легко подда­ются окислению, в результате чего приобретают разную окраску. Характер­ным примером может служить чай, различный цвет которого (черный, красный, желтый) обусловлен степенью окисления катехинов.

Катехин — оптически активное вещество, может существовать в виде 4 изомеров, отличающихся направлением и величиной угла вращения: D-катехин; L-катехин; D-эпикатехин; L-эпикатехин; одновременно возможны их рацематы: D-L-катехин, D-L-эпикатехин. Изомеры отличаются друг от друга не только физическими свойствами (температура плавления, удельное вра­щение и др.), но и биологическим действием. Например, L-эпикатехин. содержащийся в чае, обладает большей Р-витаминной активностью, чем другие изомеры катехина. Катехины в своей молекуле могут иметь до 5 гидроксильных групп — в положении 3, 5, 7 и 3', 4', являясь, таким образом, пентаоксифлаваном.

Лейкоантоцианидины, или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы). Со­единения, близкие к катехинам. Они тоже бесцветны, но при нагревании с кислотами превращаются в антоцианидины и становятся окрашенными веществами. Обычно лейкоантоцианидины существуют в свободном виде (негликозилированы). В качестве типичного примера этой группы соедине­ний можно привести лейкоцианидин, у которого имеются 4 дополнительные гидроксильные группы (в положении 5, 7, 3 , 4').

Антоцианидины. Особенностью строения этих соединений является на­личие свободной валентности у кислорода в пирановом кольце. Благодаря положительному заряду, антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, в щелочном растворе — как анионы и образуют соли с основаниями. В зависимости от рН среды изменяется и окраска антоцианидинов. Соли катионов антоцианидинов окрашены в красный цвет с оттенками: желтоватым (пеларгонидин), фиолетовым (цианидин), синеватым (дельфинидин). Их щелочные соли окрашены в синий цвет. Увеличение числа гидроксильных групп в молекуле антоцианидина (в кольце В) усиливает интенсивность синей окраски, а увеличение числа метоксильных групп — красной окраски.

В природе известно до 22 антоцианидинов, сочетанием которых обусловлено все разнообразие окраски цветков, листьев и плодов. Наиболее распространен цианидин, пеларгонидин и дельфинидин.

ОН

Антоцианидины

Цианидин (3, 5, 7, 3', 4'-пентаоксиантоцианидин) Пеларгонидин (3, 5, 7, 4'-тетраоксиантоцианидин) Дельфинидин (3, 5, 7, 3', 4', 5'-гексаоксиантоцианидин)

Антоцианидины обычно встречаются в природе в виде гликозидов — антоцианов. Особенно многочисленны антоцианы, содержащие цианидин. Пеларгондин чаще встречается в тропических растениях, а дельфинидин — в растениях более северных широт

Флаваноны. Эта группа флавоноидов обладает нестойким дигидро-γ-пироновым кольцом, легко (в присутствии щелочей или кислот) раскрывающимся, в результате чего они переходят в халконы. Известно сравнительно немного (около 25—30) флаванонов и их гликозидов. Обычно они встречаются с халконами. Известны флаваноны с метоксигруппами

Флаванонолы-3. Отличаются от флаванонов наличием ОН-группы у С-3. Они также лабильны, поэтому не накапливаются в растениях в значительных количествах. Встречаются чаще в свободном состоянии, чем в форме гликозидов. Типичным примером флаванонола может служить токсифолин, являющийся 3, 5, 7, 3`, 4`-пентаоксифлаванонолом

Флавоны и флавонолы. Флавоны отличаются от флаванонов, а флавонолы соответственно от флаванонолов наличием двойной связи в положении 2,3

Халконы и гижрохалконы. Эти соединения можно рассматривать как флавоноиды с раскрытым пироновым кольцом. В кислой среде халконы превращаются в флаваноны. Типичным халконом является изоликвиритигенин (корень солодки)

Ауроны. Желтые, оранжевые или оранжево-красные пигменты растений. Встречаются редко, обычно в виде гликозидов.

Некоторые флавоны. Апигенин, лютеолин, трицин

Некоторые флавонолы. Кемпферол, кверцетин, изорамнецин, мирицетин

Некоторые ауроны. Сульфуретин, ауреузидин, лептозидин

Изофлавоны. Отличаются от других групп флавоноидов положением бокового фенильного кольца, которое находится не у С-2, а у С-3.

Изофлавон

Флавоноиды встречаются как в свободном состоянии, так и в виде гликозидов. В качестве углеводной части могут быть моно-. ди- и трисахариды. Моносахаридами являются обычные для растений сахара: D-глюкоза; D-галактоза; D-ксилоза; L-рамноза; L-арабиноза. Может присоединяться также одна D-глюкуроновая кислота. Кетогексозы обычно не принимают участия в образовании флавоноидных гликозидов. Все перечисленные сахара встречаются в пиранозной форме, а арабиноза — в фуранозной форме. Сахара. как правило, соединены β-связью с фенольными гидроксилами.

Из дисахаридов во флавоноидных гликозидах наиболее распространены рутиноза (рамноза 4-глюкоза); софороза (глюкоза + глюкоза); самбубиоза (ксилоза + глюкоза). О трисахаридах известно меньше, чем о дисахаридах.

В литературе описано всего 6 трисахаридов. Следует отметить, что до сих пор не найдены флавоноидные гликозиды, содержащие более 3 остатков Сахаров. В образовании гликозидной связи могут максимально участвовать 2 гидроксильные группы. Биоза, присоединенная к агликону, может быть отщеплена либо с помощью ферментных препаратов, либо органической кислотой. Так, например, рутин расщепляется на кверцетин и рутинозу с помощью фермента, находящегося в плодах Rhamnus или же при гидролизе 10 % раствором уксусной кислоты. При гидролизе минеральной кислотой рутиноза расщепляется до глюкозы и рамнозы.

Среди гликозидных форм флавоноидов встречаются как О-гликозиды, так и С-гликозиды.

Самой обширной и разнообразной группой флавоноидных гликозидов являются О-гликозидные структуры флавоноидов. В этих соединениях сахар обычно находится у С-3. Если гликозилируется еще и другое положение, то это обычно происходит у С-7. Гликозидные структуры флаванонолов повто­ряют закономерности гликозилирования флавонолов. В гликозидах антоци-анидинов в отличие от флавонолов часто отмечаются 3,5-замещения.

Поскольку у флавонов нет 3-оксигруппы, то сахар обычно присоединя­ется у С-7. Гликозидные структуры флаванонов аналогичны структурам флавонов — большей частью встречаются 7-гликозиды.

В халконах сахар обычно находится у С-4, что соответствует С-7 флава­нонов. Ауроны присутствуют в растениях главным образом в форме 6-гли-козидов, причем положение 6 ауронов соответствует положению 7 флавонов.

Даже самые стойкие флавоноидные О-гликозиды можно расщепить на агликон и сахар путем кислотного или ферментативного гидролиза. Но С-гликозиды флавоноидов с трудом гидролизируются даже при жесткой обработке. В этих гликозидах сахар присоединен непосредственно к ядру флавона, к атому углерода в положении 8; у С-гликозидов агликоны почти исключительно принадлежат к классу флавонов.

Распространение флавоноидов в природе

Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Многие се­мейства характеризуются исключительным многообразием типов флавоно­идных соединений, содержащихся в их представителях. Флавоноидные со­единения накапливаются во всех органах растений, в основном в форме гликозидов. В лепестках цветков обычно находятся антоцианы (гликозиды антоцианидинов), обусловливая окраску большинства алых, красных, розо­во-лиловых и синих цветков. В окраске желтых цветков принимают участие флавоноловые гликозиды, ауроны и халконы, хотя наиболее важным источ­ником желтой окраски в природе являются каротиноиды. Поскольку анто-цианидины и флавонолы особенно близко связаны структурно и биогене­тически, то они часто присутствуют вместе в одинаковых гликозидных структурах. С антоцианами совместно могут находиться также гликозиды флавонов, флаванолов, ауронов и халконов. Очевидно, в зависимости от сочетаний этих соединений лепестки цветков приобретают разные оттенки. Гликозилирование флавоноидных пигментов цветков имеет существенное значение. С одной стороны, это состояние обеспечивает их устойчивость к свету и действию ферментов, с другой — в форме гликозидов улучшается растворимость пигментов в клеточном соке.

Основой окраски большинства плодов являются антоцианы. Широко распространены и флавоноловые гликозиды. В листьях из флавоноидов преобладают флавоноловые гликозиды; антоцианов в них сравнительно мало. В семенах флавоноиды могут находиться в свободном и связанном состояниях, например флавонол кверцетин. Функция флавоноидов в семенах неясна. Вы­сказано предположение, что они могут быть ингибиторами прорастания.

Выделение флавоноидов из растительного материала

Для флавоноидов, как и для других природных веществ, не существует способа выделения, универсального для всех растительных материалов. В каждом конкретном случае прибегают к наиболее подходящему методу или сочетанию методов с учетом в основном свойств веществ и особенностей химического состава растительного сырья. Наиболее часто используются избирательная экстракция, осаждение с помощью солей тяжелых металлов и хроматографические методы.

Метод избирательной (селективной) экстракции заключается в извлече­нии флавоноидов из растительного материала различными растворителями в определенной последовательности. Часто, особенно при работе с сухим материалом, используют растворители с возрастающей полярностью. С по­мощью низкокипящего петролейного эфира и четыреххлористого углерода вначале добиваются удаления воскообразных и смолистых веществ. В даль­нейшем в большинстве случаев флавоноиды удается полностью извлечь этанолом или метанолом. Избирательная экстракция для флавоноидов при­обрела особо важное значение с введением в практику хроматографических методов анализа с применением различного рода сорбентов.

Для отделения и очистки многих флавоноидов иногда используют их способность образовывать нерастворимые в воде и этаноле соли при взаи­модействии с ионами тяжелых металлов, а также влияние рН на образование таких осадков. Флавоноиды, содержащие свободные ортогидроксильные группы в кольце В, при обработке их спиртовых растворов солями среднего или основного ацетата свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый и красный цвета. Осадки затем центрифугируют и после суспензирования в разбавленных спиртах разлагают с помощью сероводорода. Далее флаво­ноиды отделяют либо путем перекристаллизации, либо хроматографически-ми методами. При этом широко применяют адсорбционно-хроматографи-ческий метод с использованием полиамидного сорбента — капрона. Веще­ства лучше адсорбируются на полиамиде из водных растворов, чем из растворов малополярных или неполярных растворителей, например бензола, четыреххлористого углерода, дихлорэтана и т.д.

Элюирование с полиамида проводят растворителями — водой, этанолом, метанолом, ацетоном, едким натром, формамидом и диметилформамидом. При этом простые фенолы хорошо элюируются водой и этанолом, а полимерные соединения (дубильные вещества) — только ацетоном, едкими щелочами.

Методы исследования флавоноидов

Для доказательства наличия фенил-бенз-γ-пиронового ядра и идентифи­кации отдельных типов флавоноидов используют реакции восстановления, хроматографические методы исследования, щелочную деструкцию. Приме­няя разные восстановители, получают различные производные флавоноидов.

Для идентификации и разделения флавоноидов широко используют хро­матографические методы: на бумаге, в тонком слое (ТСХ) и газожидкостную хроматографию (ГЖХ). При бумажной хроматографии применяемые реак- тивы позволяют ориентировочно установить тип флавоноидов и гидроксиль-ных фупп у С-3, С-5, С-7.

Реактив Вильсона (0,5 г борной кислоты и 0,5 г безводной лимонной кислоты в 20 мл безводного метанола). При обработке хроматограммы и после высушивания при температуре 100— ПО "С зелено-желтая флюоре­сценция в УФ-свете указывает на наличие 5-оксифлавонов и 5-окси- и 5-метоксифлавонолов; желтая флюоресценция — на присутствие 5-окси и 5-метоксихалконов.

2 % раствор хлорокиси циркония в метаноле. Хроматограммы обрабаты­вают реактивом: а) желтая окраска (видимый свет) или зеленая флюоресцен­ция (УФ-свет) указывают на наличие 5-оксифлавонов и 5-оксифлавонолов; б) пятна, имеющие желтую окраску, вырезают и обрабатывают 5 % водным раствором лимонной кислоты; исчезновение желтой окраски или зелено-желтой флюоресценции указывает на присутствие 3-гликозидов флавонолов, 5-оксифлавонов.

Реактив Мартини—Беттоло (раствор пятихлористой сурьмы в четырех-хлористом углероде). Желтая или желто-оранжевая окраска указывает на наличие флавонов, флавонолов, флаванонов и изофлавонов; красная или красно-фиолетовая — халконов (предварительное определение).

Реакция азосочетания. В качестве реактива используют свежеприготов­ленный раствор диазотированного сульфаниламида. Появление тотчас же оранжево-красной окраски в видимом свете указывает на присутствие 7-ок-сифлавонов, 7-оксифлавонолов, 7-оксиизофлавонов. Появление окраски через 1—2 мин подтверждает наличие 7-оксифлаванонов. Поскольку в ре­акцию азосочетания вступает ряд фенольных соединений, то ее следует выполнять после установления типа фенольного соединения.

Для определения места присоединения сахарного компонента прибегают к ацетилированию или метилированию с последующим гидролизом. Гидро­лиз гликозидов проводят разбавленными растворами минеральных или ор­ганических кислот, а также с помощью ферментов, избирательно расщеп­ляющих определенный тип гликозидной связи. После проведения гидролиза и удаления агликона гидролизат нейтрализуется и в нем принятыми мето­дами исследуют состав Сахаров.

Медико-биологическое значение флавоноидов

Изучение обширного класса растительных пигментов, известных под названием флавоноиды, относится к началу XIX в.

Интерес к флавоноидным соединениям возрос особенно в 40-е годы XX столетия. В 1936 г. Сент-Дьерди обнаружил, что сумма флавоноидов, полу­ченная из кожуры лимона, обладает Р-витаминной активностью. В настоя­щее время общепризнанно, что флавоноиды обладают широким диапазоном фармакологического действия. Из огромного числа работ, посвященных исследованию флавоноидов, видно, что эти вещества могут с успехом при­меняться в качестве сердечно-сосудистых, спазмолитических, противовос­палительных, диуретических, антимикробных и других лекарственных средств. В последние годы появились сообщения о противоопухолевом действии флавоноидов.

Однако в качестве официнальных лекарственных средств флавоноиды используются пока ограниченно. Значительно чаще о них говорят как о веществах, входящих в состав суммарных (галеновых, новогаленовых) пре­паратов.

Биосинтез флавоноидов

Биосинтез флавоноидов достаточно хорошо изучен. Установлено, что он идет смешанным путем. Ядро А образуется по ацетатному пути, кольцо В — через шикимовую кислоту.

Образование кольца В. Образовавшаяся при гликолитическом распаде сахаров шикимовая кислота при участии АТФ последовательно проходит через ряд промежуточных соединений и превращается в префеновую кис­лоту.

Префеновая кислота является ключевым промежуточным веществом в биосинтезе не только флавоноидов, но и кумаринов, ароматических амино­кислот и других фенольных соединений. Она способна превращаться в целый ряд продуктов, и один из таких путей превращения приводит к образованию п-кумаровой кислоты. Вначале происходит аминирование префеновой кислоты с одновременным ее декарбоксилированием. Образуется тирозин, дезаминирование которого приводит к n-кумаровой кислоте, фор­мулу которой можно написать двояко, причем второе обозначение отчетливо показывает кольцо В, вернее, структурный фрагмент —С₃—C₆.

Образование кольца А. Уксусная кислота (точнее, ацетил-коэнзим А) полимеризуется в триуксусную кислоту, которая вступает в реакцию с л-ку-маровой кислотой. Далее в результате их конденсации, замыкания цепи и энолизации образуется халкон.