Обеспечение вирусной безопасности донорской крови

Первостепенной проблемой службы крови на современном этапе является обеспечение вирусоинфекционной безопасности гемотрансфузий.

Это связано со стремительным распространением вирусных заболеваний как среди населения вообще, так и среди потенциальных доноров.

Контаминация компонентов крови бактериями, вирусами или лейкоцитами остается проблемой. Кроме того, технические возможности тестирования крови не дают полной гарантии ее вирусобезопасности, особенно в серонегативный период вирусоносительства, продолжительность которого варьирует у различных вирусов. Учитывая важность этой проблемы в нашем центре разработан целый комплекс мероприятии , направленных на предотвращение передачи инфекционных заболевании при переливании крови. К ним относятся методы лейкофильтрация крови,карантинизации и вирусной инактивации плазмы и концентрата тромбоцитов, ПЦР- диагностика донорской крови

Лейкофильтрация - один из способов обеспечения инфекционной безопасности донорской крови , который используется в нашем центре. Профильтрованные через устройство консервированная кровь и эритроцитные среды более чем на 99% обеднены лейкоцитами, их содержание составляет менее 1х106 в единице профильтрованной среды.

Фильтрование эритроцитных сред через устройство обеспечивает предупреждение температурных неспецифических реакций, иммунных реакций негемолитического типа, легочного дистресс-синдрома, опасности развития болезни “трансплантат-против-хозяина”, переноса ряда вирусных инфекций, HLA-аллоиммунизации.

В профильтрованных эритроцитных средах лучше сохраняются функциональные свойства красных клеток крови, не образуются микросгустки при хранении.

Показания к применению: трансфузии профильтрованных эритроцитных сред, обедненных лейкоцитами, показаны трансфузионнозависимым, иммуносупрессивным реципиентам, а также больным с отягощенным трансфузиологическим и акушерско-гинекологическим анамнезом, особенно при наличии у больных анти-HLA-антител.

Карантинизация – это хранение заготовленных гемокомпонентов с запретом их использования на протяжении определенного времени до повторного обследования донора.Учитывая максимальную продолжительность латентного периода гемотрансмиссивных инфекции , установлен срок карантина 6 месяцев.Вся плазма хранится в низкотемпературных морозильных камерах при температуре -40град.

Для вирусинактивации используется система инактивации патогенов в тромбоцитах и плазме – "Intercept blood system", которая позволила значительно снизить риск гемотрансфузий пациенту.

Особенности системы "Intercept blood system": - инактивация оболочечных (ВИЧ-1, вирус Западного Нила, герпес и др.) и безоболочечных (гепатит А, аденовирус, парвовирус В 19 и др.) вирусов, грамположительных и грамотрицательных бактерий; - инактивация остаточных донорских лейкоцитов и предотвращение синтеза цитокинов, являющихся причиной развития посттрансфузионных негемолитических реакций; - отсутствие влияния на биологические функции тромбоцитов.

Принцип работы "Intercept blood system". В дозу КТ добавляли 15,2 мг амотосалена (класс псоралены). Амотосален связывается с нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК). Формирование комплекса амотосален - нуклеиновая кислота эффективно ингибирует репликацию нуклеиновой кислоты, ее транскрипцию и трансляцию. Процесс репликации вируса становится невозможным. Облучение КТ, смешанный с амотосаленом, УФ лучами (длина волны 320-400 нм) в течение 4-5 минут. Под действием УФ лучей амотосален перекрещивает генетический материал в патогенах, чем предотвращает их размножение.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод ПЦР был разработан американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 г. на основе применения открытой им термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы). Принцип метода состоит в увеличении в 106--108 раз числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемого in vitro ДНК-полимеразой в автоматическом режиме.

В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического для определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности. Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликонов) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.

К достоинствам метода ПЦР следует отнести:

• высокую чувствительность, позволяющую определять 10--1000 клеток в пробе;

• высокую специфичность, поскольку в исследуемом материале выявляется уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;

• универсальность процедуры обнаружения различных возбудителей из одной биопробы;

• высокую скорость анализа (4-4,5 ч);

• возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.

Безопасная кровь начинается с донора. Не забывайте, что пациент нуждается в крови здорового человека. Ваше желание помочь другому должно быть безопасным .Безопасность донорской крови может обеспечить основанное на взаимном доверии сотрудничество донора и центра крови.

Мукатаева К.Л.врач-трансфузиолог Мангистауский ГККП «ОЦК»

Русанов В.М., Левин И. «ЛЕЧЕБНЫЕ ПРЕПАРАТЫ КРОВИ», ИД Медпрактика, Москва, 2004 г. 284 с., ISBN 5-901654-68-4

Плазма крови, применяемая для трансфузий и изготовления препаратов, сохраняет опасность заражения больного, несмотря на тщательный отбор и обследование доноров. Плазма, как и другие продукты крови, может явиться источником заражения такими "экзотическими" инфекциями, как малярия, токсоплазмоз, бабезиоз, болезнь Шигаса и другими, которые все чаще встречаются в медицинской практике в связи с оживлением миграционных процессов, международного туризма.

Серьезной медико-социальной проблемой стали туберкулез, сифилис. Уровень заболеваемости сифилисом за 10 лет возрос примерно в 67 раз, причем "современный" сифилис характеризуется преобладанием скрытых форм, атипичным проявлением и устойчивостью к терапии.

Около 20–30% доноров-носителей вируса гепатита В не выявляется на ранних стадиях заболевания с применением теста на Австралийский антиген. Исследования, проведенные Красным Крестом США выявили более 9 млн. кроводач, которые были произведены в период сероконверсии инфицированных доноров. Сопоставимые данные были получены в других странах. В Российской Федерации вероятность заражения больных при лечебном применении крови, плазмы и их дериватов также велика.

Технические возможности тестирования крови не дают полной гарантии ее вирусобезопасности, особенно в серонегативном периоде ("фаза окна") вирусоносительства, продолжительность которого варьирует для различных вирусов (табл. 4).

Помимо медицинских, морально-этических аспектов этой проблемы существенное значение приобретает экономический фактор.

В Российской Федерации функционируют предприятия, на которых ежегодно перерабатывается несколько десятков тысяч литров плазмы. Технологический процесс предусматривает объединение в стартовые загрузки от 200 до 800 литров исходной плазмы, что означает ее смешивание в пулах от 500 до 1500 доноров. Несмотря на то, что доноры проходят соответствующий отбор и обследование, достаточно часто возникает ситуация, когда из медицинских служб (кожно-венерологические диспансеры, санитарно-эпидемиологические станции) поступает информация о заболевании лиц, сдавших ранее кровь на плазму. Плазма таких доноров, как доброкачественная, чаще всего уже была введена в производственный процесс. Если даже одна порция плазмы от одного заболевшего донора попадает в пул от 500–1500 доноров, то вся плазма или уже полученная из нее продукция должны быть уничтожены.

Моральный ущерб и финансовые потери трудно недооценить. Ситуация еще более драматична, когда такая плазма была направлена в лечебные учреждения и перелита пациенту.

Даже у неспециалиста возникает вопрос: "Почему же, зная о "фазе окна", плазму не выдерживают определенное время для возможного получения информации о заболевании или вирусоносительстве донора и изъятия такой "плохой" плазмы?"

Совершенно правильный вопрос! Тем более известно, что свежезамороженная плазма может храниться длительное время (до года) при температуре –200С, не теряя лечебных свойств.

Такую выдержку (карантинизацию) плазмы уже давно практикуют за рубежом, в ряде стран не прошедшую карантинизацию плазму запрещено использовать в лечебных целях. Продолжительность карантинизации определяется национальными органами здравоохранения и составляет от 3 до 6 месяцев.

На Московской Станции переливания крови впервые в стране было организовано отделение карантинизации плазмы, оснащенное низкотемпературным оборудованием для хранения до 30 тыс. литров замороженной плазмы. Предполагается подвергнуть карантинизации всю плазму, заготовленную на СПК и во всех ОПК лечебных учреждений города, и со временем запретить ее применение для переливания и переработки без карантинной выдержки.

Очевидно, что эффективность карантинизации будет достигнута при хорошо отлаженных оперативных контактах с донорами. Практика успешного взаимодействия между службами и учреждениями здравоохранения г. Москвы, совершенствующееся информационное обеспечение дают основание полагать, что внедрение карантинизации явится действенным и существенным фактором борьбы с распространением вирусных заболеваний, связанных с трансфузионным лечением. Кроме того, создание хранилища свежезамороженной плазмы позволит иметь возможность оказать медицинскую трасфузионную помощь при массовых поражениях населения в экстремальных ситуациях.

Тестирование на вирусный антиген обычно проводится для гепатита В и ВИЧ. Скрининг поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) достаточно эффективен, так как синтез антивирусного протеина происходит уже на ранней стадии заболевания. Тем не менее, кровь может быть инфектогенна при наличии вируса в не выявляемом этим методом титре. Более того, чувствительность метода может быть снижена в присутствии антител. В случаях СПИДа и гепатита С, наоборот, в ранней фазе инфекции в крови циркулирует очень малое количество вирусных антигенов, что потенциально снижает значение скрининг тестов. В течение первого года после введения Американским Красным Крестом антигенного тестирования крови доноров на ВИЧ p24 в период "окна" и до сероконверсии было получено только 2 положительных результата (и 44 ложно положительных) из проведенных 6,75 миллионов обследований.

Содержание вирусов в пуле плазмы может быть ограничено за счет тщательного отбора доноров и тестирования индивидуальных порций на антивирусные антитела или вирусный антиген. Распространено суждение о максимальной безопасности донорского пула, составленного из порций крови от добровольных доноров. В действительности же данные подтверждают, что кровь от постоянных платных доноров менее всего подвержена вирусной контаминации. Это свидетельствует, что источником проблемы вирусного заражения является эпидемиология донорской популяции, а не вознаграждение за сданную кровь. Процесс отбора должен регламентироваться очень строгими критериями возможного возврата ранее отведенного донора и тщательной регистрацией кроводач, обеспечивающей невозможность попадания в пул плазмы отводимых доноров. Некоторые вирусы, передаваемые при трансфузии, в частности цитомегаловирус и HTLV-1, присутствуют исключительно в клетках крови и потому не опасны при терапии белковыми препаратами плазмы. Некоторые характеристики вирусов, переносимых при трансфузиях, указаны в таблице 5.

Из них наиболее серьезная патология может быть вызвана ВИЧ, вирусами гепатита В (HBV) и гепатита С (HCV). Другие патогены представляют существенно меньшую опасность. Парвовирус В19 часто переносится концентратами факторов свертывания, но связанное с этим состояние обычно не дает клинической симптоматики или имеет легкие и кратковременные признаки.

Концентраты фактора VIII указывались в качестве источника нескольких ограниченных вспышек гепатита А; протромбиновый комплекс и фактор IX, обработанные С/Д методом, также переносили этот вирус. Как и Парво 19, гепатит А обычно вызывает легкую или даже доклиническую форму заболевания и не сопровождается хроническим носительством. К тому же, для его профилактики у контингента риска существует эффективные вакцины. Оба вируса имеют малые размеры и не имеют липидной оболочки, что создает большие трудности при попытках обезвредить их в плазматических препаратах вследствие резистентности к химическим методам инактивации.

Среди других потенциально опасных вирусов, через концентраты факторов и другие плазматические препараты, вероятно, передавался вирус гепатита G (HGV), однако его патогенность и тропизм к печеночной клетке остаются сомнительными. HGV вероятно будет чувствителен к способу инактивации других липидоболочечных вирусов, хотя это и предстоит уточнить.

Недавние публикации подняли в сообществе больных гемофилией тревогу в плане возможного переноса с препаратами болезни Крейцфельда-Якоба (CJD), человеческой формы трансмиссионной спонгиформной энцефалопатии (TSE). Возбудитель заболевания был идентифицирован как необычный агент, названный "прион", который при попадании в процесс фракционирования, вероятно, будет устойчив к применяемым методам инактивации вирусов. Несколько успокаивает тот факт, что диагноз TSE ни разу не был поставлен больному гемофилией, на протяжении 30-летней истории применения концентратов факторов свертывания, полученных из больших пулов плазмы. Однако, учитывая очень долгий инкубационный период CJD, 30 лет может оказаться недостаточным для полного исключения возможности передачи этого инфекционного агента. Тестирование прионов находятся в стадии разработки и после валидации станет важным инструментом обеспечения безопасности препаратов крови. Предварительные данные позволяют предположить, что прионы циркулируют в крови в значительно меньших концентрациях по сравнению с нервной тканью, и их можно эффективно отделить от плазмы с помощью рутинных способов очистки преципитацией, ионообменной хроматографией и гельфильтрацией.

Совершенствование методов тестирования крови, несомненно, снижает опасность трансмиссии вирусов при трансфузиях. Для лабораторного исследования крови все шире применяется ПЦР-генотестирование, как наиболее чувствительный и достоверный метод выявления инфекции. Достаточно дорогой ПЦР-метод находит практическое применение, благодаря технологической модификации обследования минипулов плазмы, что существенно снижает его стоимость. Некоторые производители ввели в технологическую документацию как обязательную процедуру метод обнаружения вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или сходной технологии генной амплификации. Значение ПЦР заключается в ее высокой чувствительности к HBV, которая превышает чувствительность антигенного тестинга на 6 порядков.

В отношении ВИЧ инфекции сегодняшние данные ПЦР позволяют обнадеживающе предположить, что серологически промежуточные доноры и серонегативные доноры высокого риска могут быть источником инфицирования с очень малой вероятностью. ПЦР тестирование также значительно чувствительнее по сравнению с p24 тестированием. В исследовании Американского Красного Креста ПЦР обследование показало, что 44 из 46 p24 положительных порций крови и все из 1216 p24 промежуточных порций были в действительности РНК негативными. Поэтому, если ПЦР тестирование отдельных порций и будет введено на практике, p24 обследование можно исключить из употребления. ПЦР тестирование с обратной транскриптазой имеет преимущества для обнаружения ВИЧ при отсутствии антигенного тестирования. Парвовирус В19 также представляется реальной целью для такого обследования, учитывая его относительную устойчивость к инактивации.

Ложно отрицательные результаты возможны на подпороговом уровне вирусного заражения. Это может происходить в ранней стадии вирусной инфекции, так называемом асимптоматическом периоде "окна", или в позднем периоде хронического носительства, когда виремия или серологический ответ организма хозяина существенно снижаются. Одним из способов "закрытия" этого "окна" является карантинизация свежезамороженной плазмы на достаточное время (например, 3 месяца) и повторного тестирования первоначально негативных доноров.

Абсолютной эффективности карантинизации для плазмы ожидать не приходится, поскольку диагностические методы не обеспечивают гарантированного выявления инфицированных доноров в период сероконверсии. Неизбежны также технические ошибки, нет уверенности, что каждый донор после кроводачи будет находиться в поле зрения медиков.

Методы удаления или инактивации неспецифичны для отдельных вирусов. Поэтому нет необходимости проводить специфические процедуры для каждого известного патогена. К тому же, эти методы потенциально способны снизить риск передачи вирусов, о нахождении которых в пуле плазмы не было известно. Однако эффективность методов удаления или инактивации вирусов имеет свои ограничения и, в любом случае, они представляют собой компромисс между способностью уничтожить вирус и необходимостью избежать избыточной денатурации белка. Поэтому эти методы дополняют процесс отбора и скрининга доноров, но не заменяют их.

Методов инактивации вирусов известно достаточно много, хотя лишь некоторые из них разрешены для использования в производстве лечебных средств из крови.

В технологическом процессе применяются методы преципитации, центрифугирования, фильтрации и хроматографии, фракционирования с использованием этанола. На стадиях фракционирования происходит сокращение концентрации контаминирующих вирусов путем физического отделения вирусных частиц от белков и их удаления.

Подтверждено, что в результате процесса фракционирования по Кону-Онкли удаляются и инактивируются вирусы, как имеющие липидную оболочку, так не имеющие ее:

Вирусы, имеющие оболочку:

• ВИЧ-1 (также модельный вирус для ВИЧ-2)

• Вирус вирусной бычьей диареи (BVDV – модельный вирус для гепатита С)

• Вирус ложного бешенства (PRV – модельный вирус для герпеса, CMV, вируса Эпштейн-Барра).

Вирусы, не имеющие оболочку:

• Вирус гепатита А

• Свиной парвовирус (модельный вирус для парвовируса В19)

• Реовирус типа 3 (модель для не оболочечного вируса с высокой устойчивостью к действию физико-химических методов инактивации).

Обработка с помощью растворителей с детергентами (C/D метод) представляет собой химический процесс, при котором осуществляется инактивация вирусов посредством разрушения структуры липидной оболочки. Используемые в процессе растворители и детергенты разрушают липидный покров вируса, препятствуя сцеплению его с клеткой-мишенью и лишая инфектогенности. Для этой цели применяют растворитель три-Н-бутилфосфат (TNBP) в сочетании с детергентом ("Полисорбатом 80" и холатом натрия). Имеются обширные данные, которые доказывают эффективность использования этого метода против вирусов гепатита В, гепатита С и ВИЧ при производстве препаратов иммуноглобулина и антигемофилических факторов. Остаточные количества химических средств, используемых в этом процессе, удаляются из конечного продукта ультрафильтрацией, диафильтрацией или колоночной хроматографией.

Если инактивация вирусов в препаратах крови практикуется достаточно давно, то обеззараживание свежезамороженной плазмы применяется сравнительно недавно, на протяжении последнего десятилетия

Необходимость инактивации плазмы для трансфузий очевидна, поскольку свежезамороженная плазма продолжает занимать существенное место в лечебной практике. Инактивированная С/Д методом плазма впервые была лицензирована в Германии в 1991 году и рутинно применяется во Франции, Австрии, Нидерландах. В Норвегии и Бельгии С/Д плазма полностью заменила свежезамороженную. В США было перелито более 2 млн. доз плазмы, обработанной С/Д методом, без единого случая передачи вирусов больному.

Фирма "OCTAPHARMA" в кооперации с Нью-йоркским Центром Крови применяет следующую технологическую схему инактивации вирусов в свежезамороженной плазме на основе сольвент/детергентного метода.

Одногруппную плазму собирают в пул и смешивают с органическим растворителем 1% три(n-бутил)фосфатом и неионным детергентом – 1% Тритоном Х-100. Смесь перемешивают 4 часа при 300С. Инактивирующие вирус агенты удаляются экстракцией касторовым маслом, затем хроматографически на гидрофобном носителе. Добавляют глицин (3%), pH корректируют до 7,4. На финальной стадии плазму стерилизуют фильтрацией (0,22 мкм), асептически расфасовывают по 200 мл в пластикатные мешки, быстро замораживают и хранят при температуре –300С. Вирусбезопасный продукт, названный "OCTAPLAS", практически не отличается от свежезамороженной плазмы по лечебным, биологическим и физико-химическим свойствам.

По имеющимся у нас данным Нью-йоркского Центра Крови стоимость оборудования для одномоментной обработки 400 литров свежезамороженной плазмы около 700 тыс. долларов США, и технологическая установка предназначена для длительной многолетней работы (в стоимость не входят расходные материалы и реактивы). Расходы на оснащение и приобретение технологического "ноу-хау" окупаются в зависимости от интенсивности технологического процесса и количества обработанной свежезамороженной плазмы. Конечно же, стоимость вирусинактивированной плазмы на 50–100% превысит цену свежезамороженной плазмы (сегодня около 50 долларов США). Однако не всегда могут быть приняты прозаические соображения эффективности затрат, когда речь идет о безопасности трансфузий.

Инкубирование при низких значениях pH в присутствии этанола – одна из стадий процесса производства препарата иммуноглобулина для внутривенного введения. Низкие значения pH, инкубирование в течение 21 суток при температуре от 210С до 270С приводит к инактивации вирусов, имеющих липидную оболочку, без повреждения иммуноглобулинов.

Тепловая обработка – способ инактивации, при котором инфекционность вирусов ликвидируется посредством их тепловой денатурации. Применяют нагревание в растворе (пастеризация при 600С в течение минимум 10 часов), так и нагревание в высушенном виде при 800С в течение 72 часов. Выбор способа зависит от термолабильности белкового продукта. Некоторые препараты подвергаются как влажной, так и сухой тепловой обработке в герметичной упаковке, что позволяет снизить риск контаминации. На эффективность сухой тепловой обработки оказывают влияние содержание остаточной влаги и присутствие инертных наполнителей.

Методы фильтрования обладают преимуществом снижения концентрации потенциальных вирусов ввиду отсутствия неблагоприятного воздействия на структуру белков. Метод глубинной фильтрации иммуноглобулина для внутривенного введения эффективен для удаления вирусов, имеющих оболочку, так и безоболочечных вирусов.

Разработаны новые типы фильтров ("PALL", ФРГ; "PLANOVA", Япония), которые рекомендуются для удаления вирусов из биологических растворов.

Несомненный интерес представляет выпущенный на рынок фирмой "CUNO" фильтр ЗЕТА-ПЛЮС серии VR. Монолитный глубинный фильтрующий материал, несущий положительный электрокинетический заряд, задерживает вирусы, благодаря их анионобменной адсорбции на стенках структурных каналов и механическому удалению в микроскопических полостях.

Предложен новый процесс "BIOCIDE FILTRATION", основанный на глубинной фильтрации биологических жидкостей через материал, содержащий иммобилизованный йод (поливинилпирролидонйод). Свободный иод активно воздействует на микроорганизмы в процессе прохождения через фильтр, резко снижая вирулентность обрабатываемого материала.

Йод давно известен в качестве средства, инактивирующего все типы микроорганизмов: бактерии, вирусы, грибы. Несмотря на то, что молекулярный йод плохо растворим в воде, йодсвязывающие полимеры, такие как крахмал или поливинилпирролидон, создают резервуар йода, постепенно освобождающегося в водную среду. Однако пропускающая способность таких полимеров невелика, и они мало пригодны для промышленной хроматографии.

Комплекс Йод/Сефадекс представляет новый эффективный путь для доставки антивирусного агента при хроматографии больших объемов белкового раствора. Процесс экономичен и легко воспроизводим при любом производственном объеме. Основное количество йодистого содержимого удаляется на захватывающей колонке, остаточные реактивы могут быть легко удалены с помощью диафильтрации или дополнительных хроматографических ступеней на дальнейших стадиях производственного процесса.

Другой подход к химической инактивации состоит в использовании таких агентов, как трицианат натрия. Этот метод удачно применен для концентрата фактора IX, который достаточно стабилен при такой обработке.

Способы, включающие ультрафиолетовое облучение в присутствии агентов, увеличивающих к нему чувствительность, применены в производстве концентрата фактора IX. Обработка ультрафиолетом-С является многообещающей технологией, которая сможет стать дополнительным способом обеспечения вирусной безопасности концентратов факторов свертывания.

В Германии разрешен к применению метод фотохимической инактивации свежезамороженной плазмы. В каждую индивидуальную порцию плазмы вводят метиленовую синьку, которая разрушающее действует на вирус при окислении под воздействием световых лучей определенной характеристики, интенсивности и регламентированным временем экспозиции. "Метилен-блю" метод эффективно воздействует как на покрытые липидной оболочкой вирусы, так и на безоболочечные вирусы. Банки крови Германии и Швейцарии применяют эту технологию с 1992 года, за эти годы перелито более 1,5 млн. доз обработанной метиленовой синькой плазмы – ни одного сообщения об инфицировании больных не поступило.

Гамма лучи являются электромагнитным излучением или фотонами, которые не несут электрического заряда и не обладают значительной массой, благодаря чему свободно проникают в вещества. Гамма лучи используются для стерилизации медицинского инструментария, оптических растворов, фармацевтических и тканевых культур. Доза, требующаяся для уничтожения бактерий в этих материалах, составляет 0,7–2,5 мрад. Так как размер вирусного генома значительно меньше размера бактериальной ДНК, то для инактивации вируса требуются большие дозы гамма радиации. Доказано, что требуемая для уничтожения микроорганизма доза обратно пропорциональна размеру конкретной нуклеиновой кислоты-цели.

Микроорганизмы инактивируются нанесением повреждения геному путем удара радиацией по нуклеиновой кислоте или за счет реакции между ней и свободными радикалами, возникающими при действии радиации на молекулу воды. Свободные радикалы могут также вступать в реакцию с белковыми препаратами, разрушая их при этом. Любой фактор, способный уменьшать образование свободных радикалов, защищает белок от радиационного поражения, например, замораживание и лиофилизация. Однако такая защита белка может заодно сберегать вирусы, поэтому необходимы тщательные исследования для уточнения параметров, при которых эффект вирусинактивации сочетается с максимальным сохранением свойств белкового препарата.

Гамма-облучение лиофилизированных плазматических препаратов (фибриногена, фактора VIII, иммуноглобулина и антитромбина) также инактивирует вирусы обеих групп. В лиофилизированном факторе VIII достигнута редукция вирусов, равна 4 log (то есть > 99,99%).

Фирма Pentose Pharmaceuticals (VTTEX с 1999 года) разработала технологию INACTINE инактивации вирусов в препаратах и клеточных компонентах крови. В основе метода лежит применение низкомолекулярных электрофильных агентов, названных компонентами INACTINE, которые селективно и необратимо инактивируют репликацию нуклеиновых кислот.

Компоненты INACTINE имеют уникальное свойство активироваться в химически активное состояние после ионного связывания с нуклеиновыми кислотами. Эта химическая реакция, обозначенная как активация связыванием с нуклеиновыми кислотами (NABA), обеспечивает биохимическую основу селективной токсичности к патогенам, не повреждает белки, эритроциты и тромбоциты. Небольшой размер молекул INACTINE позволяет пенетрировать и инактивировать вирусы, которые ранее были резистентны к вируцидиым процессам. Инактивируется широкий спектр патогенов включая оболочечные и безоболочечные вирусы.

Применение технологии в производственном процессе предусматривает следующие стадии: добавление INACTINE, инкубация, нейтрализация и/или удаление остаточных компонентов. В инкубационном периоде происходят три основные химические реакции, благодаря которым нуклеиновая кислота модифицируется INACTINE:

1) ионное связывание с РНК или ДНК,

2) активация компонентов связыванием с нуклеиновой кислотой,

3) ковалентная модификация нуклеиновой кислоты.

В несвязанном состоянии компоненты INACTINE имеют низкую реактивность к биомолекулам. Однако пространственное распределение зарядов ионов на молекуле определяет возможность связывания с фосфатными группами нуклеиновой кислоты одно- и двухцепочечных молекул РНК или ДНК. После начального шага связывания происходит перестройка внутренней электронной структуры молекулы INACTINE, которая переходит в активную форму. Затем формируется ковалентная связь с существующими во всех нуклеиновых кислотах сильными нуклеофильными остатками. Благодаря этому химическому видоизменению нуклеиновая кислота вируса не может реплицироваться, и вирион теряет инфектогенность.

Механизм активации INACTINE связыванием с нуклеиновой кислотой уникален. Он обеспечивает биохимическую основу для селективной инактивации патогенов без повреждения белков. Например, при условиях, ведущих к снижению титра парвовируса свиней на 6 порядков, выход из плазмы лабильных белков – факторов V, VII и VIII превышает 85%. Аналогично сохранено связывание IgG с антигенами краснухи и кори, а также активация комплемента (СН50 активность).

Обработка IgG с помощью INACTINE не дает образования димеров и не приводит к изменению электрофоретических профилей при изоэлектрофокусировании или SDS.

Комитет по патентованным медицинским препаратам (СРМР) требует, чтобы в состав всех производственных процессов были включены эффективные методы инактивации и удаления вирусов. Исследования по подтверждению антивирусной эффективности проводятся при преднамеренном лабораторном заражении материала модельным вирусом (эта процедура известна под названием "пикового введения"). После инактивирующего воздействия проводится тестирование материала на отсутствие инфектогенности введенного вируса.

"Модельные" вирусы применяются при исследованиях, подтверждающих эффективность удаления и инактивации вирусов в тех случаях, когда невозможно вырастить настоящий вирус в искусственной культуральной среде. Модельный вирус сходен с оригинальным размером и биохимическими свойствами и может быть использован для оценки результатов воздействия.

Эффективность удаления и (или) инактивации вирусов выражается в логарифмах снижения инфектогеннности вирусов по отношению к исходному значению. Стандартной единицей является доза заражения 50% культуры ткани на миллилитр – "50 percent Tissue Culture Infectious Dose per milliliter" (TCID50/мл). Измеряется TCID50 по логарифмической шкале в десятичных логарифмах (log10 или lg), то есть в показателях степенной функции с основанием, равным 10. Логарифм снижения вирусной инфектогенности представляет собой разность между максимальным и минимальным значениями величины TCID50/мл. Например, если на каком-либо конкретном этапе удаления вирусов происходит снижение инфектогенности с 106 TCID50 /мл до 103 TCID50 /мл, это эквивалентно уменьшению логарифмического значение на 3 единицы.

Для того, чтобы оценить коэффициент общего снижения вирусной инфектогенности, достигнутого в результате использования нескольких стадий очистки, нельзя просто суммировать уменьшение логарифмических значений на этих стадиях. Необходимо оценить эффективность каждого отдельного этапа или процесса и убедиться в том, что он удовлетворяет всем критериям эффективности стадии инактивации или удаления вирусов. Эффективным считается снижение десятичного логарифма инфектогенности на 4 (снижение в 10.000 раз или на 99,99% относительно исходного значения). При этом необходимо принимать во внимание, что стадии очистки, на которых происходит снижение десятичного логарифма инфектогенности на 1 или менее, считается неэффективными.

Безопасность препаратов является не только следствием использования методов удаления и инактивации вирусов, но и результатом сочетания таких мер, как тщательный отбор доноров, тестирование плазмы донорской крови, строгих требований к хранению запасов. Необходимо следование точному описанию регулируемых производственных процессов, содержащемуся в GMP.

Требования к процессам удаления и инактивации вирусов в различных странах отличаются. В настоящее время на международном уровне предпринимаются активные усилия по гармонизации различных директив, предписаний и правил, существующих сегодня на всех уровнях управления. Международная Конференция по гармонизации призвана сближать предписания, действующие в США, Европе и Японии. В 1975 году был создан Комитет по патентованным медицинским препаратам (CPMP) как первый паневропейский директивный орган (Директива Совета Европы 75/319). В 1986 году организована Рабочая Группа по биотехнологии и фармации для решения вопросов по научным и нормативным аспектам работ с биологическими и биотехнологическими препаратами, в том числе обеспечения вирусной безопасности.

При производстве медицинских препаратов, поступающих на рынок ЕС, должны соблюдаться Технические Условия процессов удаления и (или) инактивации вирусов и требования Предписаний по соответствию производственной технологии – GMP (директива 91/336ЕЕС). Этот порядок изложен в Приложении к Руководству ЕС "Предписание по соответствию производственной технологии при производстве препаратов, получаемых из крови и плазмы крови человека" (III/3232/9).