3. Молекулярно-биологические методы

Методы выявления ДНК или РНК возбудителя (ПЦР) PCR Методы определения структуры 16S рРНК малой субъединицы бактериальной рибосомы – метод риботипирования ПЦР (PCR) - Полимеразная цепная реакция -метод выявления ДНК или РНК возбудителя

ПЦР Разработал амер. исс.- Кэрри Муллис, Ноб. лауреат 1993г. 1985г. in vitro - репликация участков ДНК.

Цель - обнаружение незначительных количеств ДНК (вирусной, бактериальной, простейших) в клиническом материале от больного. Не является абсолютно точным (случаются ошибки), но он очень специфичен, т.к. основан на уникальном свойстве ДНК – комплементарности, при этом должно произойти взаимодействие участков ДНК возбудителя из клинического материала от больного и имеющихся в диагностическом наборе фрагментов ДНК-возбудителя – праймеров.

Метод PCR включают несколько этапов 1. выделение ДНК 2. амплификация 3. детекция

Материал: кровь, любая ткань, моча, кость, соскобы со слизистых специальными щеточками. Идентификация останков тоже осуществляется этим способом, т.к. в костях ДНК сохраняется много десятков лет. Этот этап очень ответственный, необходимо использовать специальные приемы для взятия материала, правильной транспортировки. Лучше всего брать материал и сразу же проводить исследование. Амплификация - умножение ДНК возбудителя из клинического материала. 25-35 циклов умножения. Теоретически можно иметь всего 1 копию ДНК возбудителя в клиническом материале и ее размножить. Детекция - определение интересующих фрагментов ДНК – нуклеотидов.

Комплект для PCR ДНК-возбудителя из кл. материала – фрагмент нуклеотидов, который нужно определить. Смесь нуклеотидов – супермикст, из которых будет строиться новые, вновь синтезируемые фрагменты ДНК. Затравки-праймеры – искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигомеры), Соответствующие фрагментам ДНК определенных возбудителей. Они нужны для того, чтобы начался синтез новой цепочки ДНК только в том случае, если ДНК-возбудителя из клинического материала комплементарно совпадет с ДНК-затравкой, соответствующей ДНК предполагаемого возбудителя. ДНК-полимераза (термостабильная) – фрагмент, сшивающий нуклеотиды (из термофильной бактерии Thermus aquaticus).

Условия проведения ПЦР Объемы реактивов, используемые в работе: Объем супермикса – 20 мкл Объем ДНК-полимеразы – 20 мкл Обязательное условие – соблюдение идеальной чистоты!!!

Этапы амплификации - 1-й этап денатурация (ДНК возбудителя из клин. материала) Т° = 94°С → 2 цепочкирасходятся, рвутся водородные связи между азотистыми основаниями →1-цепочечные молекулы ДНК. С этого момента 1-цеп. молекулы ДНК возбудителя называются – амплификатор 1 и 2. - 2 этап - связывание (отжиг) праймеров к амплификатору амплификатор 1 связывается с праймером 1, амплификатор 2 с праймером 2 Связывание происходит в случае комплементарного совпадения участка праймера с амплификатором. Праймеры должны соответствовать предполагаемым возбудителям. При 62°С. 3-й этап – синтез новой цепи ДНК ДНК достраивается из нуклеотидов супермикста. Строится ампликон. Именно эту реакцию осуществил Кэрри Муллис в 1985г. Скорость синтеза – 1 нуклеотид/ 1 мин. Все повторяется примерно 30 раз. Занимает 2,5 часа. При 72°С (оптимальная температура для работы термостабильной ДНК-полимеразы.

Детекция - существует несколько способов: Электрофорез в агарозном геле ДНК – гибридизация ИФА на микрочастицах

PCR характеризуется 2 важными параметрами Высокая чувствительность Высокая специфичность

Чувствительность зависит от - Интенсивности инфекционного процесса - Правильного отбора проб - Сроков и условий транспортировки материала - Правильного выделения ДНК из материала - Качества реактивов - Точности этапа амплификации - Эффективности системы детекции результатов