Растворимость
. Растворимость, являющаяся важным функциональным свойством белка, существенно влияет на его способность к образованию пены и эмульсий. Гомогенное распределение белка в жидкости играет также важную роль при желировании для образования сетчатой структуры. Денатурирующие факторы, такие, как сильные колебания величины рН, центрифугирование при высоких скоростях или нагревание, снижают растворимость сывороточных белков в широком диапазоне рН: от 3 до 8. Для растворения основных, присутствующих в сывороточных белковых концентратах белков - р-лактоглобулина и иммуноглобулина в диапазоне рН 4-5, необходима небольшая концентрация минеральных солей (например, 0,1 М NaCl). В растворах с низкой концентрацией солей р-лактоглобулин и иммуноглобулин проявляют в типичном для всех глобулярных белков изоэлектрическом диапазоне нестабильность и могут выпадать в осадок. Эти белки можно опять перевести в раствор добавляя соль или повышая рН, например, до 7,0. Эти важные свойства белков были изучены Баргесс и Келли. По данным этих авторов, белковый препарат из молочной сыворотки, выделенныи с помощью ионообменной хроматографии, растворим при рН 3,0 и 8,0 на 98%, но при РН 4,5 его растворимость 35% Растворимость полученных из молочной сыворотки с помощью ультрафильтрации и других методов мембранного разделения белковых концентратов в диапазоне рН 3-8 доходит, как правило, до 90%. Нагревание, которое имеет место в процессе распылительной сушки, влияет на растворимость белка в незначительной степени. Пастеризация раствора СБК может, напротив, повлечь за собой 20%-ную денатурацию и потерю растворимости в изоэлектрической точке. Из-за остаточных количеств осаждающих веществ растворимость выделенных с помощью метафосфата, карбоксиметилцеллюлозы или солей железа сывороточных белков сильно зависит от величины РН. Очень характерны при этом слабая растворимость сывороточных белков при низких значениях рН (21/о при рН 2,0) и ее увеличение при повышении рН (86% при рН 8,0). Исключение составляют сывороточные белки, осаждаемые полиакриловой кислотой. Их растворимость в диапазоне рН от 3,0 до 9,0 составляет 100%. При нагревании концентрированной молочной сыворотки до С при рН 2,7-3,3 белковый осадок также не образуется. Концентрирование молочной сыворотки до 17,5% сухого вещества при аналогичном нагревании и значении рН 2,5 ведет к выпадению сывороточных белков, которые после выделения являются по большей части растворимыми. Применение сывороточных белковых препаратов в пищевых продуктах с жидкой консистенцией представляется затруднительным из-за низкой тепловой стабильности белков.
Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ И МЕТОДЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ
Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.
Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях.
Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств, а также возможности специфично связываться с лигандом.
А. Физико-химические свойства белков
Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду
67
молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.
1. Различия белков по форме молекул
Как уже говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).
2. Различия белков по молекулярной массе
Белки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).
3. Суммарный заряд белков
Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.
Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО- + Н+ → -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH3+с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:
-NH3+ +ОН- → -NH2 + H2O.
Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют"изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.
Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.
Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (- ). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.
4. Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков
На поверхности большинства внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.
68