Цитогенетические исследования

Цитогенетические исследования позволяют выявлять нарушения кариотипа - числа и структуры хромосом. В кариотипе человека 46 хромосом; из них две хромосомы определяют пол человека (X и Y). Нормальный мужской кариотип содержит половые хромосомы XY, женский – ХХ.

Цитогенетические исследования проводятся с целью выявления хромосомной патологии. Такая патология может являться причиной бесплодия, а также тяжёлой хромосомной болезни ребёнка, например, синдрома Дауна (дополнительная 21-я хромосома). Нарушения могут затрагивать половые хромосомы. Так, при синдроме Клайнфельтера в кариотипе мужчины имеется дополнительная X хромосома (состав половых хромосом XXY вместо XY).

Кариотипирование

Стандартное цитогенетическое исследование – кариотипирование – проводится с целью выявления нарушений числа и структуры хромосом.

Для анализа кариотипа клетки крови помещаются в питательную среду и культивируются трое суток. После этого проводятся этапы фиксации, приготовления препаратов, окрашивание и изучение под микроскопом. Стандартный цитогенетический анализ включает специальное окрашивание хромосом G-бэндинг (GTG).

Показаниями для кариотипирования с использованием клеток крови являются бесплодие, невынашивание беременности, подозрение на хромосомную патологию у ребенка или взрослого, задержка полового развития, отсутствие менструаций, пороки развития. Кариотипирование проводится для доноров яйцеклеток и сперматозоидов, а также рекомендовано всем супружеским парам при планировании беременности.

 В случае замершей беременности рекомендуется проведение кариотипирования абортивного материала. Хромосомные аномалии у эмбриона и плода могут являться причиной неразвивающейся беременности. В связи со сложностью проведения цитогенетического исследования абортивного материала, существует вероятность того, что результат не будет получен в ходе исследования. Такая вероятность составляет около 20%. Причинами невозможности получения результата могут быть плохой рост клеток в культуре (например, из-за длительного периода между остановкой развития плода и проведением медицинского аборта), контаминация культуры бактериями, грибами во время проведения медицинского аборта, контаминация культуры клетками матери.

а) 46,XY Нормальный мужской кариотип;

б) 46,XX Нормальный женский кариотип;

в) 45,XY,der(14;15)(q10;q10) Робертсоновская транслокация между хромосомами 14 и15;

г) 47,XXY Синдром Клайнфелтера.

 Спектральное кариотипирование (SKY) и флуоресцентная гибридизация (FISH) являются дополнительными методами цитогенетических исследований. На такие исследования обычно направляет врач-генетик в случаях, когда необходимо дополнительное цитогенетическое обследование.

 SKY

Cпектральное кариотипирование (Spectral Karyotyping - SKY) – новый, высокоэффективный метод цитогенетического исследования, позволяющий быстро и наглядно идентифицировать хромосомные нарушения в случаях, когда сложно установить происхождение хромосомного материала методами стандартного кариотипирования. Метод основан на 24-цветном флуоресцентном окрашивании целых хромосом. Хромосомные перестройки и маркерные хромосомы идентифицируются с помощью SKY по цвету.

SKY является инструментом клинического хромосомного анализа транслокаций, маркерных хромосом, сложных межхромосомных перестроек. SKY выявляет также численные хромосомные нарушения. Точная диагностика хромосомного дефекта дает возможность разработать подход для преимплантационной диагностики в случаях сложных нарушений в кариотипе родителей.

 FISH

FISH (флуоресцентная гибридизация) является современным эффективным методом исследования численных хромосомных нарушений, а также сложных случаев нарушений в кариотипе. В основе метода лежит специфическое связывание флуоресцентных меток с определёнными участками хромосом. Анализ может проводиться на клетках крови без культивирования и позволяет анализировать большее число клеток, чем при стандартном кариотипировании. Материалом для  FISH-исследования являются не только клетки крови, но и другие клетки (например, сперматозоиды, клетки плода, эмбриона).

 

Преимплантационная генетическая диагностика

    Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) или доимплантационная диагностика представляет собой анализ генетических нарушений у эмбрионов до их имплантации в полости матки. Это новое направление в области генетической диагностики и репродуктивных технологий. Исследование проводится на самом раннем этапе развития человеческого организма - на этапе, когда возраст эмбриона всего несколько дней, и он состоит из нескольких клеток. Такая диагностика возможна только при проведении лечебного цикла экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). ПГД (доимплантационная диагностика) позволяет предотвратить перенос генетически неполноценного эмбриона в полость матки. Главным преимуществом ПГД является то, что она проводится еще до наступления беременности.

    Впервые преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) была проведена в 1990 году. В настоящее время ПГД проводится во многих странах, активно развивающих вспомогательные репродуктивные технологии. В мире родилось уже более 2500 детей после ПГД.

   Красноярский центр репродуктивной медицины – первый центр Сибирского региона, внедривший ПГД в клиническую практику. Первая пациентка Красноярского центра репродуктивной медицины, забеременевшая после ПГД, страдала бесплодием в течение 10 лет и предприняла 5 безуспешных попыток ЭКО, ЭКО-ИКСИ. В шестом лечебном цикле ЭКО-ИКСИ была проведена ПГД хромосомных нарушений. Генетическая диагностика показала, что из шести полученных эмбрионов лишь три оказались генетически полноценными, т.е. имели нормальный хромосомный набор по исследованным хромосомам. В полость матки было перенесено два эмбриона женского и мужского пола. 24 октября 2005 года женщина благополучно родила здоровых мальчика и девочку в Железнодорожном родильном доме г. Красноярска.

     В зависимости от цели и методов исследования выделяют три основных направления ПГД:

• диагностика числовых нарушений хромосом (анеуплоидии);

• ПГД при транслокациях;

• ПГД моногенных дефектов.

В случае ПГД числовых нарушений хромосом (анеуплоидии) выявляются отклонения от нормального числа хромосом, которые могут приводить к тяжелым болезням, таким как синдром Дауна (трисомия 21), синдром Патау (трисомия 13), синдром Эдвардса (трисомия 18). ПГД при транслокациях проводится для случаев перестроек в кариотипе одного из супругов с целью выявления несбалансированных хромосомных нарушений у эмбриона, которые могут являться причиной невынашивания беременности или тяжелого врожденного заболевания ребенка. Оба типа ПГД являются цитогенетическими исследованиями и выполняются методом FISH. ПГД моногенных дефектов проводится для случаев, когда у супругов имеется высокий генетический риск тяжелого наследственного заболевания, связанного с мутациями определенного гена. К наследственным заболеваниями, в отношении которых осуществляется ПГД относятся муковисцидоз, фенилкетонурия, адреногенитальный синдром, врожденный поликистоз почек, нейрофиброматоз, гемофилия, мышечная дистрофия Дюшенна, спинальная амиотрофия  и многие другие генные болезни в тех случаях, когда супруги обследованы и имеют заключение молекулярно-генетического исследования. При ПГД моногенных дефектов применяются молекулярно-генетические методы. Исследование включает прямой анализ мутаций и косвенный анализ сцепленных маркеров.

 

В каких случаях врач рекомендует ПГД

   ПГД – это реальная возможность рождения здорового ребенка для:

 

• женщин старше 35 лет;

• супружеских пар после неоднократных неудачных попыток ЭКО;

• мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза (единичные сперматозоиды, высокий процент аномальных сперматозоидов и т. д.);

• женщин с привычным невынашиванием в анамнезе (особенно в случаях прерывания беременности на ранних сроках);

• супружеских пар с высоким генетическим риском (семейные случаи наследственных заболеваний, аномалии кариотипа).

 

Как проводится ПГД?

    Проведение преимплантационной диагностики возможно только в рамках лечебного цикла ЭКО, а точнее ЭКО-ИКСИ. Подготовка к лечебному циклу и сам лечебный цикл ЭКО с ПГД практически не отличаются от обычного лечебного цикла: женщина получает гормональные препараты для стимуляции суперовуляции, производится трансвагинальная пункция фолликулов, оплодотворение яйцеклеток сперматозоидами в условиях эмбриологической лаборатории. Перенос эмбрионов проводится на 5-6 сутки. Особенностью лечебного цикла является то, что при проведении циклов ЭКО с ПГД используется процедура ИКСИ. Это необходимо в связи с тем, что при обычном ЭКО к яйцеклетке добавляется большое количество сперматозоидов. Затем, при заборе полярных телец или бластомеров, есть риск попадания в анализ вместе с клеткой эмбриона генетического материала сперматозоида, не участвовавшего в оплодотворении.

     Собственно доимплантационная генетическая диагностика проводится после получения фолликулов и оплодотворения, в период развития эмбриона in vitro, до переноса в полость матки. Материалом для генетического исследования при проведении ПГД является генетический материал яйцеклетки и эмбриона. Генетический материал яйцеклетки, полученной в программе ЭКО, исследуется косвенным образом по полярным тельцам. Диагностика генетических нарушений по полярным тельцам более подробно рассмотрена в соответствующем разделе. Первое полярное тельце получают до оплодотворения, второе – после оплодотворения. После оплодотворения эмбрион развивается – клетки делятся. На третий день эмбрион состоит из 6-8 клеток, которые называются бластомерами. Один бластомер забирается для генетического исследования. Получение полярных телец и бластомеров проводится с помощью специальных микроманипуляций и носит название биопсии эмбрионов. Считается, что такая процедура не нарушает дальнейшего развития эмбриона. Полученные клетки (полярные тельца, бластомеры) используют для генетического исследования. 

    В то время пока выполняется генетическая диагностика, эмбрионы продолжают развиваться в соответствующей культуральной среде до переноса в полость матки на 5-е сутки развития. К этому времени эмбрион должен достичь стадии бластоцисты. Перед переносом эмбриолог оценивает строение и форму эмбрионов (морфологию). Результат генетической диагностики сопоставляется с морфологией эмбрионов и делается заключение о том, какие эмбрионы рекомендуются для переноса в матку. Для переноса отбирают самые лучшие по морфологическим характеристикам эмбрионы без генетических нарушений. Генетические исследования, выполняемые в рамках ПГД, высокотехнологичны. Анализ проводится на очень малом количестве материала – на забранных с помощью биопсии полярных тельцах и бластомерах – и в очень сжатые сроки. Для анализа бластомеров доступно всего 2 суток. Эмбрион не может продолжать свое развитие вне организма матери далее стадии бластоцисты (5-е сутки после оплодотворения), поэтому исследование обязательно должно быть выполнено за это короткое время.

    Для проведения преимплантационной диагностики применяются с одной стороны новейшие, с другой стороны - проверенные методы генетических исследований. Для ПГД числовых хромосомных нарушений, ПГД при транслокациях в нашем центре применяется метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ). При проведении ПГД моногенных заболеваний применяется метод ПЦР.