Добавил:

Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Тюменский государственный медицинский университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

infektsia_i_immunitet.doc

Скачиваний:

Добавлен:

29.04.2019

Размер:

412.67 Кб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 23 / 33

Характеристика бактериальных экзо- и эндотоксинов

Свойства	Экзотоксины	Эндотоксины
Химическая природа	Белки (9-19 аминокислот). Имеют бифункциональную структуру: транспортная группа взаимодействует со специфическими рецепторами клетки; токсическая (активатор) проникает внутрь клетки и блокирует жизненно важные метаболические процессы.	ЛПС с белком
Происхождение	Выделяются в процессе жизнедеятельности, чаще Гр⁺бактерий. Обнаруживаются в фазе активного роста бактерий.	Связаны со структурами бактерий, выделяются при разрушении клеток, чаще Гр" бактерий.
Механизмы действия	1. Повышение проницаемости мембраны (мембранотоксины) эритроцитов гемолизины, лейкоцитов - лейкоцидины и др. клеток. 2. Блокада синтеза белка и других биохимических процессов в клетке (цито-, энтеро-, нейротоксины). 3. Нарушение взаимосвязи и взаимодействия между клетками (функциональные блокаторы).	1. Общетоксическое действие. 2. Основная «точка приложения» - макрофаги, которые в ответ на действие эндотоксина выделяют эндогенные пирогены (интерлейкин-1). Ил-1 действует на центр терморегуляции и вызывает лихорадку. 3. Дилатация мелких кровеносных сосудов. 4. Повреждение эндотелия. 5. Запуск каскадов коагуляции (ДВС-синдром), что приводит к эндотоксическому шоку. 6. В небольших дозах эндотоксины повышают неспецифическую резистентность, т. к. усиливают фагоцитоз; активируют комплемент, обладая свойствами адъюванта.
Отношение к температуре	Термолабильны	Термостабильны
Степень ядовитости	Очень токсичны	Менее токсичны
Скорость действия	После инкубации 19-72 часа	Довольно быстро
Специфичность действия	Выражена	Лишена тропизма
Отношение к химическим веществам	Чувствительны к спирту, щелочам, кислотам, пищеварительным ферментам, при действии формалина переходят в анатоксин (применяется как вакцина).	Малочувствительны к химическим веществам, не переходят в анатоксины.
Антигенные свойства	Активные антигены	Слабые антигены

III. Факторы персистенции

Персистенция - длительное переживание возбудителя в организме

Факторы	Механизмы персистенции
Капсула, оболоченный антиген	Экранирование клеточной стенки и препятствия фагоцитозу
L-формы	Утрата клеточной стенки
Антигенная мимикрия	Антигенное сходство с клетками макроорганизма
Секретируемые микробные факторы - антилизоцимная активность(АЛА) -антикомплементарная активность (АКА) - антииммуноглобулиновая Активность (АИГА) - антиинтерфировановая активность (АИА)	Инактивация механизмов естественной (неспецифической) защиты хозяина

Методики выявления:

а) плазмокоагулирующей активности бактерий

Посев выделенной культуры бактерий проводят в разведённую физ. раствором 1:4 стерильную цитратную плазму крови. Пробирки ставят в термостат при 37°С на 2 - 5 часов. При наличии у выделенной культуры фермента плазмокаогулазы происходит коагуляция плазмы, а при отсутствии данного фермента жидкость будет прозрачной.

б) наличия фибролизина

Продлив время пребывания пробирок в термостате, можно наблюдать растворение сгустка, что свидетельствует о наличии фибринолитической способности изучаемого штамма.

в) лецитиназной активности

Лецитиназная активность проявляется при посеве на агар с яичным желтком в образовании вокруг колоний характерного помутнения с радужным венчиком.

г) гемолитической активности

Гемолитическая активность проявляется при посеве на кровяной агар в образовании вокруг колоний зоны просветления

Работа № 1. Методы определения факторов патогенности и вирулентности микроорганизмов, на примере золотистого стафилококка

а) Цель: зарегистрировать результат плазмокоагулирующей активности золотистого стафилококка при посеве на цитратную плазму крови. Сделать вывод.

Самостоятельная работа:

«О» - посев S. aureus на цитратную кроличью плазму крови.

«К» - цитратная кроличья плазма

«К» «O»

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) Цель: зарегистрировать результаты опыта по выявлению лецитиназной активности у золотистого стафилококка. Сделать вывод. Посев на желточно-солевой агар (ЖСА).

в) Цель: зарегистрировать результат гемолитической активности золотистого стафилококка. Сделать вывод. Посев на кровяной агар.

Выполните задания для самоконтроля:

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ

К факторам адгезии и колонизации относятся:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

К факторам агрессии и инвазии относятся________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Заполните таблицу. Обозначьте фермент, зная его механизм действия

Механизм действия	Фермент
Расщепляет нейраминовую (сиаловую) кислоту, которая входит в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек. Это делает оболочки доступными для взаимодействия с микробами и их токсинами. Клетка, лишенная этих поверхностных рецепторов, не способна взаимодействовать с вирусами, токсинами бактерий, что препятствует инактивации микроорганизмов и токсинов.
Превращает фибриноген в фибрин и образует белковую пленку вокруг бактерий, которая защищает их от фагоцитоза.
Растворяет сгусток фибрина, который образуется в процессе воспаления и препятствует проникновению микробов вглубь органов и тканей.
Разрушает гиалуроновую кислоту, основное межклеточное вещество соединительной ткани. Это способствует проникновению микроба вглубь тканей
Действует на лецитин мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток. Разлагает лецитины и другие фосфоглицериды, входящие в состав клеточных мембран макроорганизма, что приводит к нарушению их проницаемости. Продукты гидролиза лецитинов оказывают токсическое действие на организм человека и животных.

Токсины – это__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Экзотоксины характеризуются:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Эндотоксины характеризуются:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

К факторам персистенции относятся:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 2. Цели и задачи постановки биопробы на лабораторных животных

Цель: ознакомиться с техникой заражения белых мышей. Обратить внимание на способы фиксации лабораторного животного. Записать в тетрадь цели и задачи постановки биопробы на животных (см. фильм, теоретическую справку).

Теоретическая справка

Цели и задачи постановки биопробы на лабораторных животных

Биопробу на лабораторных животных ставят с целью воспроизведения клиники заболевания, патогенеза, выявления экзотоксинов бактерий, определения типа токсина, получения чистых культур микроорганизмов, определения DLM, LDso, DCL, для испытания новых препаратов, для контроля выпускаемых медицинских препаратов на безвредность, реактогенность и иммуногенность.

Наиболее широко в микробиологической практике используют кроликов, морских свинок, белых мышей, крыс. Лабораторные животные являются донорами, у которых берут кровь для получения сывороток, плазмы, эритроцитов, лейкоцитов, необходимых при постановке многих серологических реакций и для приготовления кровяных питательных сред.

В зависимости от цели исследования пользуются различными методами заражения: внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрибрюшинным, пероральным или интраназальным. При выборе способа заражения следует учитывать, прежде всего, механизм распространения возбудителя инфекции (воздушно-капельный, фекально-оральный, трансмиссивный, контактны и др.) и тропизм возбудителей.

Внутрикожный способ заражения При этом способе применяют тонкие (№ 18 - 20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения материала растягивают I и II пальцами левой руки, правой рукой вводят иглу под очень острым углом, почти касаясь кожи. Конец иглы должен быть виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой, вследствие чего ее сравнивают иногда с лимонной корочкой. Материал вводят в объеме до 0,1 мл обычно в кожу спины или живота.

Подкожный способ заражения Кожу в месте введения материала берут у ее основания, приподнимают I и II пальцами левой руки. Иглу шприца вкалывают снизу образовавшейся складки. Проколов кожу и пройдя вглубь на несколько миллиметров, иглу отклоняют вправо или влево и затем медленно вводят материал, содержащийся в шприце. Изменять направление иглы под кожей рекомендуется для того, чтобы введенное вещество не выступало через прокол кожи наружу. Затем складку кожи отпускают, на место укола накладывают ватный тампон, смоченный спиртом или спиртовым раствором, а иглу быстро вынимают. Наиболее удобными местами для подкожного введения материала у кроликов и морских свинок являются область спины и боковые поверхности несколько ниже подмышечных впадин, у крыс и мышей - область спины, крестца и затылка. Количество жидкости, вводимой подкожно, не должно превышать 30 мл - для кроликов, 15 мл - для морских свинок, 10 мл - для крыс и 1 мл для мышей.

Внутримышечный способ заражения. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. У кроликов и морских свинок, крыс и мышей таким местом является наружная верхняя треть бедра задней лапы. Захватывают I и II пальцами левой руки толстую мышечную складку и вводят иглу почти под прямым углом в глубь мышц. Объем жидкости, допустимый для внутримышечного введения, составляет для кроликов 8 мл, для морских свинок - 5 мл, для крыс 3 мл, для мышей - 0,5 мл.

Внутрибрюшинный способ заражения Помощник держит животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. У животных (за исключением мышей) в нижней трети живота, несколько отступя от средней линии, делают скальпелем или остроконечными ножницами надсечку кожи длиной 2 -3 мм и через нее вводят притуплённую иглу, держа шприц перпендикулярно к брюшной стенке. Преодолевая сопротивление, очень осторожно, буравящими движениями иглу продвигают вглубь. Чувство "провала", исчезновение ощущения сопротивления на пути говорят о проникновении иглы в брюшную полость. После этого иглу переводят в вертикальное положение и вводят содержащийся в шприце материал в полость брюшины. Внутрибрюшинно можно вводить до 30 мл жидкости кроликам, до 10 мл морским свинкам, до 5 мл - крысам, до 2 мл - мышам.

Заражение через пищеварительный тракт

Наиболее простым и естественным является способ заражения через пищевые продукты. Инфекционный материал подмешивают к пище или питью животного. Однако этот метод в лабораторной практике нашёл ограниченное применение в связи с трудностью дозирования применяемого препарата. Поэтому для заражения животных чаще используют шприц, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы.

Интраназалъное заражение

Животному прикладывают к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступают после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глубину 1-1,5 мм мышам, 2-3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу. Фиксация мышей

Мышь пускают по столу, придерживая ее I и II пальцами правой руки за кончик хвоста. Когда, продвигаясь в каком - либо направлении, мышь натянет хвост, быстрым движением левой руки хватают ее за складку кожи в области затылка, ближе к ушам, чтобы она не могла поворачивать голову. Подняв мышь над столом, помощник держит ее на весу одной рукой за хвост, другой - за складку кожи на затылке, несколько растягивая в положении, удобном для экспериментатора.

Работать с мышами можно и без помощника, фиксируя их левой рукой: I и II пальцами левой руки животное захватывают за складку кожи в области затылка, а остальными 3 пальцами, прижав их к запястью, придерживают хвост и кожу в области крестца. При таком способе фиксирования правой свободной рукой можно производить различные операции.

Цели постановки биопробы:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Задачи постановки биопробы:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя_________________________________________________________

Тема № 2. «Иммунитет»

ЗАНЯТИЕ №2

ИММУНИТЕТ. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

Цель занятия:

изучить виды и формы иммунитета, неспецифические механизмы резистентности.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Понятие об иммунитете, виды иммунитета

2. Неспецифические факторы защиты организма человека:

• механические барьеры;

• физико-химическая защита (рН- среды, ферментативная активность лизоцима, пепсина и др.);

• клеточные факторы защиты (фагоцитоз, фагоцитирующие клетки и их классификация). Механизм и фазы фагоцитоза. Завершенный и незавершенный фагоцитоз;

• гуморальные неспецифические факторы защиты (система комплемента, Р-лизины, интерфероны, лейкины, противовирусные ингибиторы, лизоцим и др.)

Иммунобиологическое значение интерферонов. Их получение и использование.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

дать оценку значимости неспецифических факторов иммунитета.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:

о современных методах выявления неспецифических факторах иммунитета.

Работа № 1. Бактерицидная функция кожи

Цель: Зарегистрировать результаты опыта по изучению бактерицидных свойств кожи.

Теоретическая справка

Важным фактором неспецифической резистентности является функция кожи как механического барьера для внедрения паразита. Отторжение верхних слоев эпидермиса, секреты сальных и потовых желез способствуют их удалению с поверхности кожи. Существенную роль в элиминации микробов с поверхности кожи играют различные микробоцидные субстанции (молочные и жирные кислоты и др.), обеспечивающие ее «самоочищение». Поэтому различные микроорганизмы, не являющиеся ее постоянными обитателями, не могут в течение продолжительного времени сохраняться на коже. Бактерицидность кожных секретов зависит от их кислотности.

Методика.

Для определения бактерицидной активности кожи суточную бульонную культуру кишечной палочки (1:50000) наносят на внутреннюю поверхность предплечья и распределяют равномерно шпателем. Делают отпечаток на предметное стекло со средой Эндо с одного участка исследуемой кожи, а через 15 минут - со смежного. Инкубируют посевы 18-24 часа при 37° С и подсчитывают колонии на 3 см2 поверхности каждой пластины.

Индекс бактерицидности (ИБ) вычисляют по формуле:

ИБ=К1-К2х100

К1

где Kl - количество колоний сразу после нанесения на кожу,

К2 - количество колоний через 15 минут после контакта.

У здоровых людей ИБ равен 90-100%.

Самостоятельная работа:

Рассчитать бактерицидную функцию кожи по формуле:

Индекс бактерицидности

ИБ=К1-К2 х100

К1

где К1 - количество колоний сразу после нанесения на кожу,

К2 - количество колоний через 15 минут после контакта.

Сделать вывод.

Дано:

1) посев-отпечаток с участка кожи с тест-культурой на предметном стекле со средой Эндо.

2) посев-отпечаток со смежного участка кожи через 15 мин после нанесения тест-культуры

Через 15 минут

Выполните задания для самоконтроля:

Методика определения бактерицидной активности кожи________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Индекс бактерицидности рассчитывается по формуле:___________________________________________________________________

Работа № 2. Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК)

Цель: Определить БАСК по отношению к кишечной палочке по методике, предложенной А.Д. Евтушенко с соав., 1982 (см. методические указания).

Теоретическая справка

Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) является показателем естественной способности крови к самоочищению. В 1886 г. Высокович обнаружил, что различные бактерии, введенные в кровь кроликов и собак, не удаляются из организма выделительными органами, если эти микробы не повреждены. Исчезновение их из организма связано с наличием в сыворотке особых веществ, убивающих и растворяющих микробные клетки. Бактерицидное действие сыворотки крови распространяется как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии.

Методика

Из 18-ти часовой культуры кишечной палочки методом серийных разведений готовят рабочую концентрацию до 40-50 тыс. м. т. в 1 мл. По 0,1 мл рабочей взвеси тест-микробов высевают на чашку Петри с МПА. Шаблоном диаметром 20 мм по поверхности агара с культурой микроорганизмов делают отверстия (в центре и по периферии отмечают контрольные отверстия, на которые не наносятся испытуемая сыворотка). На каждую площадку с посевом тест-культуры наносят пипеткой 0,05 мл исследуемой сыворотки. Через 24 часа инкубации в условиях термостата проводят подсчет выросших колоний как на опытных, так и на контрольных площадках. Бактерицидную активность сыворотки крови рассчитывают по формуле:

БАСК(%) =100х(1- конечное количество жизнеспособных бактерий)

исходное количество бактерий

Нормативное значение - 80 - 90%.

Дано: опыт по определению БАСК у четырех пациентов

Выполните задания для самоконтроля:

Методика определения БАСК_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

БАСК рассчитывается по формуле_____________________________________________________________________

Нормативы:__________________________________________________________________

Работа №3: Фагоцитоз.

Цель: Микроскопировать готовые препараты-мазки стафилококка и гонококка. Зарисовать в тетради картину фагоцитоза микроорганизмов. Выявить отличительные особенности завершенного (№1) и незавершенного (№2) фагоцитоза в препаратах-мазках. Сделать вывод.

Теоретическая справка

Фагоцитоз (от греч. phagos - пожираю, cytos - клетка), открытый и изученный И.И. Мечниковым, является одним из основных мощных факторов, обеспечивающих резистентность организма, защиту от инородных веществ, в том числе микробов. Это наиболее древняя форма иммунной защиты. Механизм фагоцитоза состоит в поглощении, переваривании, инактивации инородных для организма веществ специализированными клетками - фагоцитами.

Фагоцитарная реакция осуществляется поэтапно. При завершенном фагоцитозе, заканчивающемся разрушением микроба, различают 4 стадии:

1) приближение фагоцита к объекту (положительный хемотаксис) обусловлено нали-

чием специфических рецепторов на мембране фагоцита;

2) прилипание (адгезия) также осуществляется за счет соответствующих рецепторов;

3) поглощение (эндоцитоз, захват) - основная физиологическая функция фагоцитов. Захват крупных частиц происходит за счет обтекания их псевдоподиями без участия специфических рецепторов (фагоцитоз). Бактерии, дрожжеподобные грибы и др. микроорганизмы захватываются посредством рецепторов фагоцитов, распознающих углеводные компоненты поверхностной структуры микроорганизмов (пиноцитоз). В результате захвата образуется фагоцитарная вакуоль - фагосома;

4) переваривание - слияние фагосомы с лизосомой и разрушение микроорганизмов лизосомальными ферментами. Если микробные антигены разрушаются частично, вслед за фагоцитозом начинается антителообразование.

Незавершенный фагоцитоз отличается отсутствием последней стадии - переваривания. Многие вирулентные бактерии часто не погибают и могут длительно находиться внутри фагоцита и даже размножаться внутри них, вызывая их гибель. Выживание фагоцитарующих микроорганизмов обеспечивают следующие механизмы:

1) одни патогенные агенты способны препятствовать слиянию лизосом с фагосомами (токсоплазмы, микобактерии туберкулеза);

2) другие обладают устойчивостью к действию лизосомальных ферментов за счет наличия микрокапсул (гонококки, стрептококк А);

3) третьи после эндоцитоза покидают фагосому, избегая действия микро-боцидных факторов и могут длительно находиться в цитоплазме фагоцитов (риккетсии).

Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток

Одной из основных функций гранулоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов) и моноцитов крови является эндоцитоз - захват различных объектов: инертных частиц (латекс, уголь), живых или убитых микроорганизмов (бактерии, дрожжеподобные грибы). Количественную оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов проводят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром от 1,0 до 2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием клеток бактерий или дрожжеподобных грибов.

Показателями клеточных факторов неспецифической защиты организма являются: активность фагоцитоза (АФ) и фагоцитарный показатель (ФП).

Определение:

- обнаруживают под микроскопом 10-20 лейкоцитов, передвигая предметное стекло так, чтобы под объективом находился край препарата из исследуемой крови;

- подсчитывают число микробов, захваченных каждым обнаруженным лейкоцитом.

ФП - среднее число микробов в одном лейкоците. Норма 4,2.

АФ - процент лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе. Норма 60%.

Даны: препараты №1-№2

Препарат №1 Препарат №2

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Теоретическая справка

Имунокоррекция

Имунномодуляторы - препараты, обладающие иммунотропной активностью, которые в терапевтических дозах восстанавливают функции иммунной системы (эффективную иммунную защиту). Определение иммунностимуляторы и иммунодепрессанты -вытекают из названий этих групп препаратов.

Препараты	Механизм действия
Полиоксидоний Сальмозан Рибомунил Метилурацил	Повышают функциональную активность моноцитов/ макрофагов
Продигиозан Пирогенал Миелонид	Повышают активность В-лимфоцитов
ИЛ-4, ИЛ-5	Запускают и стимулируют дифференцировку В-лимфоцитов
Имунофан Декарис	Корректируют функции Т-лимфоцитов
Дибазол Арбинол	Активируют синтез интерферона
Интерфероны: ИНФ-α (лейкоцитарный)	Обладает противовирусным действием. Непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и влияет на репродукцию вируса в клетке на стадии синтеза белков. Связываясь со здоровыми клетками, защищает их от вирусов.
ИНФ-β (фибробластный)	Обладает противоопухолевым действием, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток. Также обладает противовирусным действием.
ИНФ-γ (иммунный)	Обладает иммуномоделирующим действием, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование.

Иммуностимуляторы

Препараты различного происхождения и механизма действия:

• Витамины (А, Е, С)

• Минеральные элементы (Zn, Se, Си, Fe, Mg, Mn)

• Адаптогены (алоэ, каланхоэ, элеутерококк, жень-шень, лимонник)

• Препараты, содержащие кофеин

• Препараты направленного действия:

Тималин, Тактивин, Тимоген - на клеточное звено;

В-активин, Спленин - на гуморальное звено

Иммунодепрессанты

Препараты физической, химической и биологической природы, применяемые для подавления иммунной системы при аллергии и других иммунопатологических процессах.

Препараты

Механизм действия

Цитостатики

Меркаптурин Метотрексат Азотиаприн Батриден

Торможение пролиферативной фазы иммунного ответа, подавление синтеза антител (IgG), торможение клеточных иммунных реакций

Циклофосфан Хлорбутин

Подавление Т-супрессоров, Т-хелперов, В-клеток, ЦТЛ

Глюкокортикоиды

Кортизон

Кортизол

Гидрокортизон

Преднизолон

Дексаметазон

Ультран

Ингакорт

Торможение функции Т-клеток памяти, В-клеток памяти, Т-хелперов, высвобождение цитокинов. Подавление взаимодействия Т-

и В-лимфоцитов

Антилимфоцитарные антитела

Антилимфоцитарная сыворотка

Элиминация Т-лимфоцитов, инактивация Т-клеточных рецепторов

Общие принципы применения иммуномодуляторов в целом:

1. Иммуномодуляторы назначают в комплексной терапии одновременно с антибиотиками, противогрибковыми, противопротозойными или противовирусными средствами.

2. Целесообразно раннее назначение иммуномодуляторов, с первого дня применения химиотерапевтического этиотропного средства.

3. Иммуномодуляторы, действующие на фагоцитарное звено иммунитета, можно назначать больным как с выявленными, так и невыявленными нарушениями иммунного статуса, т.е. основанием для назначения препарата является клиническая картина.

4. При наличии в лечебно-профилактическом учреждении соответствующей материально-технической базы применение иммуномодуляторов целесообразно осуществлять на фоне иммунологического мониторинга, который следует проводить независимо от наличия или отсутствия исходных изменений в иммунной системе.

5. Иммуномодуляторы можно назначать в виде монотерапии при проведении иммунореабилитационных мероприятий, в частности при неполном выздоровлении после перенесённого инфекционного заболевания.

6. Понижение какого-либо параметра иммунитета, выявленное при иммунодиагностическом исследовании у практически здорового человека, не является основанием для назначения ему иммуномодулирующей терапии. Эти лица должны находиться на учете в соответствующем лечебно-профилактическом учреждении, составляя группу наблюдения по иммунному статусу.

Выполните задания для самоконтроля:

Фагоцитоз- это__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Фагоцитоз включает следующие стадии:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

Незавершенный фагоцитоз представляет собой_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Механизмы защиты микроорганизмов от фагоцитоза:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Фагоцитарный показатель-____________________________________________________________________________

Активность фагоцитоза-___________________________________________________________________________

Подпись преподавателя_______________________________________________________

ЗАНЯТИЕ №3

ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ (СЕМИНАРСКОЕ ЗАНЯТИЕ)

Вопросы, рассматриваемые на занятии:

Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса. Механизм передачи инфекции.
Формы инфекционного процесса.
Стадии развития инфекционной болезни.
Патогенность и вирулентность бактерий.
Характеристика факторов патогенности.
Токсины бактерий, их природа, свойства, получение.
Понятие об иммунитете. Виды иммунитета.
Неспецифические факторы защиты организма:

- механические барьеры

- физико- химическая защита ( рН среды, ферментативная активность лизоцима, пепсина и др.)

- клеточные факторы защиты ( фагоцитоз, фагоцитирующие клетки и их классификация). Механизм и фазы фагоцитоза. Завершенный и неавершенный фагоцитоз;

- гуморальные неспецифические факторы защиты ( система комплемента, бета- лизины, интерфероны, лейкины, противовирусные ингибиторы, лицоцим идр.)

9. Иммунобиологическое значение интерферонов. Их получение и использование.

10. Антигены: определение, основные свойства. Антигены бактериальной клетки.

11. Структура и функции иммунной системы.

12. Иммунокомпетентные клетки.

13. Антитела ( иммуноглобулины): структура и функции.

14. Классы иммуноглобулинов, и их характеристика.

15. Антителообразование: первичный и вторичный ответ.

ЗАНЯТИЕ № 4,5

РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Цель занятий:

изучить механизмы взаимодействия антиген - антитело; принципы и методы постановки следующих реакций: реакция агглютинации (РА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции иммунной флюоресценции (РИФ), иммуноферментного анализа (ИФА).

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. РА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.

2. РПГА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.

3. РП. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.

4. РСК. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.

5. РИФ. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.

6. ИФА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

использовать реакции иммунитета в диагностике инфекционных болезней

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:

о существовании различных модификаций серологических реакций, усиливающих их чувствительность (информативность)

ЗАНЯТИЕ 4

Выполните задания для самоконтроля:

Серология это_________________________________________________________________________

Серологические реакции это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Серодиагностика это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Сероиндикация это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Сероидентификация это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Серология - раздел иммунологии, изучающий взаимодействие Аг и Ат в реакциях in vitro. Серологические методы - совокупность реакций in vitro, основанных на Аг-Ат взаимодействии и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма Ат, а также Аг в исследуемом материале.

Сероиндикация - обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода возбудителя) с поливалентными сыворотками.

Сероидентификация - определение вида возбудителя или отдельных антигенов с монорецепторными сыворотками.

Серодиагностика - обнаружение антител или определение титра антител в сыворотке крови

Работа №1. Реакция агглютинации

Теоретическая справка

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген- взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Возможные ошибки при постановке реакции агглютинации:

1. Спонтанная (самопроизвольная) агглютинация. Некоторые клетки, особенно микробы в R-форме, не дают гомогенной (однородной) взвеси, быстро выпадают в осадок. Во избежание этого следует пользоваться культурой в S-форме, которая не даёт спонтанной агглютинации.

2. В сыворотках здоровых людей имеются антитела к некоторым микроорганизмам (так называемые нормальные антитела). Титр этих антител не высок, по этому положительный результат реакции в разведении сыворотки 1:50 и выше говорит о её специфичности.

3. Наличие в сыворотке антител к бактериям (антигенам), близким по строению к изучаемым (так называемая групповая реакция). Например, сыворотка больного брюшным тифом может агглютинировать также бактерии паратифа А и В. В отличие от специфической, групповая реакция идёт в более низких титрах. Адсорбированные сыворотки освобождены от групповых антител и не дают групповой реакции.

4. Следует учесть, что специфические антитела после перенесённого заболевания и даже после прививок могут сохраняться длительное время. Они называются «анамнестическими». Чтобы отличить их от «инфекционных» антител, реакцию агглютинации ставят в динамике, т.е. исследуют сыворотку того же больного через несколько дней. Повышение титра антител говорит о наличии болезни - титр «анамнестических» антител не повышается, а может даже снизиться.

Существуют два основных метода поведения этой реакции: реакция агглютинации на стекле (иногда их называют ориентировочной) и развернутая реакция агглютинации (в пробирках).

СХЕМА №1

М етоды постановки РА

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция

коагглютинации Развернутая РА на

стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбировнлиые сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

СХЕМА №2

«О» «К»

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум. Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

СХЕМА №3

Ингредиенты	номер пробирки
	1	2	3	4	5	6 (контроль сыворотки)	7 (контроль диагностикума)
Физиологический рас-	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
твор
Сыворотка больного в	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
разведении 1:50
Диагностикум (капли)	2	2	2	2	2	-	2
Разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:100	-

При положительном результате реакции в пробирках видны склеившиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

++ осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

- осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции.

Цель:

Определить родовую принадлежность выделенной чистой культуры в ориентировочной РА на стекле с поливалентными сыворотками: сальмонеллезной ABCDE, шигеллезной, иерсиниозной (сероиндикация). Поставить, учесть, оценить результат РА.

2. Определить вид исследуемой культуры в развернутой РА на стекле с

монорецепторными сальмонеллезными сыворотками: 09, 04, Ovi, 05, 012, 01, Hi, Hd HI,2 (сероидентификация). Поставить, учесть, оценить результат РА (см. теоретическую справку, таблицу №1).

3. Учесть результат РА с бруцеллезным диагностикумом с целью выявления антител в парных сыворотках больного (серодиагностика). Парные сыворотки - это сыворотки от одного и того же больного, взятые в начале болезни и через одну две недели с целью выявления нарастания титра антител. Сделать вывод. (См. схему № 3).

1-я неделя

2-неделя

1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600

Выполните задания для самоконтроля:

Агглютинация-это__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ингредиенты для постановки РА:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Феномен реакции _____________________________________________________________

Работа №2. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА)

Цель:

Учесть результат РПГА с эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом для определения специфических антител в парных сыворотках больного. Сделать вывод.

Теоретическая справка

СХЕМА№ 4

М етоды постановки РНГА

РНГА с эритроцитным антигенным диагностикумом

РНГА с эритроцитарным антительным диагностикумом

Реакция латекс-агглютинации

Реакция

Кумбса

РНГА с унитиолом

(выявление IgM и IgG)

В этой реакции микробный или растворимый антиген адсорбируется на поверхности эритроцитов, которые в таком «нагруженном» состоянии приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для микробного антигена. Учитывается реакция по образованию агглютинированными эритроцитами осадка в виде зонтика на дне планшетов, в то время как в контроле, без иммунной сыворотки; они оседают в центре, образуя пуговку с ровными краями. Реакция гемагглютинации является более чувствительной, чем агглютинация бактерий, применяется для диагностики при многих инфекционных заболеваниях, особенно у детей, при необходимости выявления антител в более низких титрах. Эта реакция может быть использована и для обнаружения антигенов при применении специфических сывороток (СХЕМА № 5).

1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 КД КС

Выполните задания для самоконтроля:

Ингредиенты для постановки РПГА:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Феномен реакции_____________________________________________________________

Работа № 3. Реакция преципитации

Теоретическая справка

РП ставят в тех случаях, когда приходится пользоваться растворимыми антигенами: лизатами, экстрактами, гаптенами. При взаимодействии такого антигена с антителом в присутствии электролитов (изотонический раствор хлорида натрия) образуется преципитат в виде мутного «кольца» или осадка.

РП обычно применяют для определения Аг при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит, пневмония и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и т. д.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений.

Для этой реакции необходимы следующие компоненты.

1. А н т и т е л а (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5-1:10.

2. А н т и г е н - растворенные вещества белковой или липоидно-полисахаридной природы (полные антигены, гаптены, экстракты или лизаты микробов или других клеток).

3. И з о т о н и ч е с к и й р а с т в о р х л о р и д а н а т р и я.

Внимание! Все компоненты, участвующие в этой реакции, должны быть совершенно прозрачными.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Методика

В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки. На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат. Реакция сопорвождается рядом контролей.

Схема постановки РП (кольпреципитация по Асколи)

Объем ингредиентов, мл		Номер пробирки

		2 (контроль)	3 (контроль)
0,2	преципитирующая	нормальная сыво-	физиологический
0,2	сыворотка	ротка	раствор
0,2	Аг из экстракта	Аг из экстракта	Аг из экстракта
0,2	шерсти	шерсти	шерсти

Реакция преципитации в геле

Иммунодиффузия в агаровом геле растворов антигенов и антител, залитых в разные лунки, навстречу друг другу в случаях соответствия их специфичности приводит к образованию специфического преципитата в виде полосок и дуг в местах встречи реагентов.

Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические - испытуемые сыворотки. В одну из периферических лунок заливается стандартная иммунная сыворотка соответствующей специфичности, а в другую -нормальная сыворотка для контроля. Проводится инкубация во влажной камере при 37°С в течение 24 ч. Учитывают количество и ширину полос преципитации между центральной лункой с раствором антигена и лунками с исследуемыми сыворотками.

Цель:

Поставить РП для выявления сибиреязвенного Аг в экстракте из шерсти животного. Оценить результат, сделать вывод.

2. Разобрать принцип постановки РП в геле (см. теоретическую справку). Сделать вывод.

Выполните задания для самоконтроля:

Реакцию преципитации ставят в том случае, если____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ингредиенты для постановки РП:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Феномен реакции____________________________________________________________

Таблица №1. Серологическая классификация бактерий рода Salmonella

Группа и вид (серовар)
	соматический антиген (О)	жгутиковый антиген (H)
		Фаза первая	Фаза вторая
Группа А
S. paratyphi А	1,2,12	а	—
Группа В
S. schottmuelleri	1,4, 5,12	b	1,2
S.abony	1,4,5,12	b	e, n, x
S. typhimurium	1,4, 5,12	i	1,2
S. derby	1,4(5), 12	f,g	(1,2)
S. Stanley	4, 5,12	d	1,2
S. heidelberg	4, 5,12	r	1,2
S. abortus-equina	4,12	—	e, n,x
S. abortus-ovis	4,12	с	1,6
S. abortus-bo vis	"1,4,12,27	b	e, n,x
Группа С (1,2)
S. hirschfeldii	6,7,Vi	с	1,5
S. cholerae-suis	6,7	с	1,5
S. tvohisuis	6.7	с	1.5
S. thomson	6,7	k	1,5
S. duesseldorf	6,8	z4	—
S. newDort	6.8	e.h	1.2
S. albany	(8), 20	z4,z24
Группа D (1)
S. typhi	9,I2,Vi	d	_
S. enteritidis	1,9,12	g, m	—
S. dublin	1.9.12	g, p	—
S. rostoc	9,12	g, p,u	—
S. moscow	1,9,12
S. gallinarum	1,9,12	i
Группа E (1,3)			-
S. london	3,10	i, v	1,6
S. anatum	3,10	e,h	1,6
S. harrisonburg	(3), (15), 34	zlO	1,6

Подпись преподавателя_________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ № 5

Выполните задания для самоконтроля:

К реакциям иммунного лизиса относятся:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Реакция иммунного лизиса

Антитела могут вызывать лизис, т.е. растворение клеток, только при участии комплемента (С). Следовательно, все реакции с участием С называются реакциями иммунного лизиса. К ним относят: РСК, р. гемолиза, р. бактериолиза.

Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты и другие клетки.

2. Антитела (лизины) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериологическая сыворотка содержит антитела, лидирующие бактерии, гемолитическая -гемолизины, способствующие лизису эритроцитов, лизис спирохет вызывают спирохетолизины, клеток - цитолизины и т. д. Титр гемолитической сыворотки - ее наибольшее разведение, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента 1:10.

3. Комплемент - неспецифический белок, содержащийся в сыворотке

человека и теплокровных животных. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок.

Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не позже 1-2-го дня после получения. Консервированный комплемент (на 10 мл сыворотки 0,2 г борной кислоты и 0,3 г сульфата натрия) сохраняется при 4°С до 2 недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют изотоническим раствором хлорида натрия до первоначального объема, указанного на этикетке.

4. Изотонический раствор хлорида натрия.

Работа № 1. Реакция связывания комплемента (РСК)

Теоретическая справка

Реакция связывания комплемента протекает в 2 фазы. В первой (специфической) взаимодействуют антиген, антитело и комплемент. Если антиген соответствует антителу, они соединяются и образуют комплекс, который связывает комплемент. Образовавшееся соединение внешне не проявляется. Об его образовании узнают с помощью индикатора, которым является гемолитическая система, участвующая во второй (индикаторной) фазе реакции. Гемолитическая система состоит из эритроцитов барана и соответствующей гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, реагируя с эритроцитами, делает их чувствительными (сенсибилизирует) к действию комплемента, в присутствии которого эритроциты разрушаются (лизируются). Если лизиса нет, значит комплемент связан первой системой и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу. Отсутствие гемолиза регистрируют как положительный ответ. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Свободный комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз эритроцитов, результат РСК при этом отрицательный.

Для постановки РСК требуется точное определение количественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому, постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов.

В РСК используют:

1. Прогретую (инактивированную) сыворотку при 56° С в течение 30 мин, чтобы разрушить имеющийся в ней С. Обычно сыворотку больного применяют в разведении 1:5-1:10, иммунные (диагностические) сыворотки - в

разведении 1:50 и более.

2. Диагностикум.

3. Комплемент в рабочей дозе. Перед опытом С обычно титруют, т. е. определяют наименьшее его количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С. Титруют С по схеме.

4. Эритроциты барана. Используют 3% взвесь отмытых эритроцитов барана.

5. Гемолитическая сыворотка.

В РСК применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки составляет 1/200, то рабочее разведение сыворотки составляет 1/400, следовательно, к 0,1 мл гемолитической сыворотки следует добавить 39,9 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Цель: Учесть результат РСК, поставленной с целью идентификации возбудителя.

О КС КА КГС

Выполните задания для самоконтроля:

Ингредиенты для постановки РСК:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

5.___________________________________________________________________________

Результатом первой фазы РСК является_____________________________________________________________________

Результатом второй фазы РСК является_____________________________________________________________________

Работа № 2. Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)

Теоретическая справка

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки обрабатывают флюорохромами (ФИТЦ), которые соединяются с антителами. Сыворотки при этом не теряют своей иммунной специфичности. При взаимодействии полученной люминесцентной сыворотки с соответствующим антигеном образуется специфический светящийся комплекс, легко видимый в люминесцентном микроскопе.

Различные иммунофлюоресцентные сыворотки могут быть использованы для прямого и непрямого метода иммунофлюоресценции. При прямом методе специфические флюоресцирующие иммунные сыворотки готовят для каждого микроба путем иммунизации кролика убитой культурой возбудителя, затем иммунную сыворотку кролика соединяют с флюорохромом (изоционат или изо-тиоционат флюоресцеина). Метод применяется для экспресс-диагностики с целью обнаружения бактериальных или вирусных антигенов.

Непрямой метод предусматривает использование диагностической иммунной нефлюоресцирующей сыворотки (иммунизированного кролика или больного человека) и флюоресцирующей сыворотки, имеющей антитела против видовых глобулинов диагностической сыворотки.

Цель:

Разобрать механизм прямой и непрямой РИФ, использую схему № 4. Указать практическую значимость (см. теоретическую справку)

Прямой метод РИФ

Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Непрямой метод РИФ

Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выполните задания для самоконтроля:

Ингредиенты для постановки прямой РИФ:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Иммунные сыворотки в РИФ обрабатываются______________________________________________________________

Ингредиенты для постановки непрямой РИФ:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

Феномен реакции_____________________________________________________________

Работа № 3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

Теоретическая справка

Широкое применение находит твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинилхлорида. Один из наиболее распространенных на практике вариантов ИФА основан на использовании меченных ферментом специфических антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе инкубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген-антитело. Затем носитель отмывают от не связавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные ферментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определяют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления не связавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антиглобулиновых антител выявляют специфические иммунокомплексы. Данная схема является одной из наиболее распространенных в ИФА.

СХЕМА №5

Специфические Исследуемый материал- Специфические антитела Субстрат

антитела возбудитель с пероксидазой для пероксидазы

СХЕМА №6

Исследуемая АГС

сыворотка Субстрат для

Специфический пероксидазы

антиген

Контроль:

позитивный - иммунная сыворотка, меченная пероксидазой + субстрат - 2 лунки;

негативный - нормальная сыворотка + субстрат - 2 лунки.

Цель:

Разобрать механизм прямого (1) и непрямого (2) метода ИФА (см схему № 5, 6; теоретическую справку). Указать практическую значимость

1 .

«О» «КН» «КП»

1/14 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 «КН» «КП»

Выполните задания для самоконтроля:

Иммуноферментный анализ основан на______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ингредиенты для постановки ИФА:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

Феномен реакции_____________________________________________________________

Подпись преподавателя_________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ № 6

Антигенные препараты. Вакцины, аллергены, диагностикумы.

Цель занятия:

1. Выработать четкое представление об антигенах, их роли в иммунном ответе.

2. Ознакомиться с антигенной структурой микроорганизмов.

3. Ознакомиться с принципами изготовления, хранения антигенных препаратов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Антигены: определение, основные свойства.

2. Антигены бактериальной клетки.

3. Характеристика антигенных препаратов. Методы получения антигенов и их практическое использование.

4. Определение понятия «вакцина». Вакцинотерапия и вакцинопрофилактика инфекционных заболеваний.

5. Характеристика вакцинных препаратов (живые, инактивированные, субклеточные, анатоксины, генно-инженерные). Достоинства и недостатки вакцин.

6. Способы приготовления и введения вакцин.

7. Требования, предъявляемые к вакцинам

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• классифицировать наиболее распространенные антигенные препараты

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:

1. О технике приготовления вакцин и диагностикумов.

2. О методах стандартизации и проверки на стерильность, безвредность вакцин и диагностикумов.

Выполните задания для самоконтроля:

Антигенные препараты - это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Диагностикумы- это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Аллергены- это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Токсины-это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вакцины- это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 1. Антигенные препараты

Цель:

1. Составить схему классификации антигенных препаратов: вакцин,

диагностикумов, аллергенов, токсинов (см. лекцию и методические

рекомендации).

2. Классифицировать предложенные антигенные препараты. Записать в

тетрадь.

Дано: набор антигенных препаратов.

Название
Классификационное положение
Действующее начало
Принцип получения
Применение
Методика применения

Название
Классификационное положение
Действующее начало
Принцип получения
Применение
Методика применения

Название
Классификационное положение
Действующее начало
Принцип получения
Применение
Методика применения

Работа № 2. Иммунобиологические препараты. Убитые вакцины. Диагностикумы

Цель: изучить этапы приготовления убитой вакцины.

Теоретическая справка

Методика приготовления убитой аутовакцины

I этап. Из суточной агаровой культуры сделать смыв 5 мл физиологического раствора.

II этап. Проверить на чистоту культуры. Приготовить микропрепарат и микроскопировать.

III этап. Прогреть микробную взвесь на водяной бане при 70 - 80°С в течение часа.

этап. Контроль на стерильность (сделать посев гретой культуры на питательные среды).
этап. Провести стандартизацию вакцины (диагностикума) оптическим методом. 1 мл прогретой микробной взвеси разводят мерным количеством стерильного физ. р-ра, сравнивая ее мутность с мутностью оптического стандарта (5 ед - 500 млн. микр. тел, 10 ед - 1 млрд. микр. тел). Остальной объем микробной взвеси разводят, добавляя соответствующее количество изотонического раствора хлорида натрия.
этап. Проверить вакцину на безвредность и иммуногенность (биопроба).

Дано: методические рекомендации

Подпись преподавателя_________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ №7

АНТИТЕЛА. ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Цель занятия:

сформировать понятие об иммунологических антительных препаратах (их классификации, принципах получения и применения).

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

Антитела (иммуноглобулины): структура и функции.
Классы Ig, их характеристика.
Антителообразование: первичный и вторичный ответ.
Классификация антительных препаратов.
Принципы получения и применения антительных препаратов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

классифицировать наиболее распространенные иммунные сыворотки;
визуально оценить качество антительных препаратов, применяемых с лечебно- профилактическими целями

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:

О технике приготовления сывороточных препаратов
Об условиях транспортировки и хранения медицинских иммунобиологических препаратов.

Выполните задания для самоконтроля:

Метод Безредка используется для_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Сыворотки- это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Иммуноглобулины- это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Интерфероны- это______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 1. Антительные препараты (сыворотки)

Цель:

Составить схему классификации антительных препаратов: лечебно-профилактических и диагностических сывороток по способу получения, по направленности действия, по степени очистки (см. лекцию и методические рекомендации)
Классифицировать предложенные сывороточные препараты.

Дано: набор сывороток.

Название
Классификационное положение
Действующее начало
Принцип получения
Применение
Методика применения
Название
Классификационное положение
Действующее начало
Принцип получения
Применение
Методика применения

Название
Классификационное положение
Действующее начало
Принцип получения
Применение
Методика применения

Работа № 2. Монорецепторные сыворотки

Цель: изучить метод получения монорецепторных сывороток по

Кастеллани.

Теоретическая справка

При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических антител. Полученные сыворотки называются монорецепторными, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара.

Дано: методические рекомендации, таблица.

Работа № 3. Специфическая десенсибилизация. Метод A.M. Безредка

Цель: Изучить метод десенсибилизации по A.M. Безредка для профилактики анафилактического шока при введении в организм сывороток. Записать в тетрадь механизм десенсибилизации.

Теоретическая справка

У сенсибилизированных анафилактогеном животных анафилактическое состояние сохраняется в течение многих месяцев, а у человека - практически всю жизнь. В целях предупреждения анафилаксии у человека А. М. Безредка предложил способ специфической десенсибилизации организма посредством дробного введения аллергена, который постепенно связывает анафилактические антитела. Предварительно определяют чувствительность организма к белку.

Методика

В сгибательную поверхность предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл чужеродной сыворотки, разведенной 1:100. При отрицательной реакции, проявляющейся образованием папулы диаметром 9 мм с небольшим ободком покраснения, через 20-30 мин поочередно вводят 0,1 мл и 0,2 мл цельной сыворотки, а спустя 1,0 -1,5 часа - остальную дозу. В случае положительной внутрикожной пробы с инфильтратом более 10 мл десенсибилизация вначале проводится разведенной 1:100 сывороткой в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 5 мл с интервалом 20 мин, а затем с теми же промежутками три раза цельной - 0,1; 0,2 оставшийся объем. Состояние десенсибилизации непродолжительно и у животных через 5-14 дней вновь сменяется сенсибилизацией.