3.1.2. Выявление косвенных показателей

3.1.2.1. Определение общих колиформных бактерий (бгкп)

Показатель БГКП идентичен показателю «общие колиформные бактерии» (ОКБ).

ОКБ — грамотрицательные, неспоровые, оксидаза-отрицательные палочки, способные развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста. Ферментируют лактозу при

35-37 ^оС за 24-48 час с образованием кислоты, газа и альдегида, т.е. на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24-48 час.

В зависимости от загрязнённости почвы БГКП можно определять титрационным методом для почв с невысокой степенью фекального загрязнения), либо методом мембранных фильтров (для слабозагрязненных почв ), либо методом прямого посева на среду Эндо (для почв с высокой степенью загрязнения).

Чаще используют титрационный метод.

Титрационный метод

Из разведения 1:10 почвенной суспензии 10 см³ засевают на 90 см³ среды Кесслера, остальные разведения сеют по 1 см³ в 9 см³ среды. Посевы выращивают при температуре 37 ^оС 48 часов. При отсутствии роста (помутнение, газообразование) дают отрицательный ответ. При наличии помутнения и газообразования или при наличии только помутнения делают высев на среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при 37 ^оС 18-24 час. Отбирают розовые, красные или малиновые с металлическим блеском колонии, изучают морфологические, тинкториальные свойства, ставят оксидазный тест. По 2-3 колонии каждого типа (грамотрицательные, оксидазаотрицательные) засевают параллельно в 2 в пробирки с полужидкой или жидкой с поплавком средой с лактозой, инкубируют в термостате 37 ^оС 18-24 час. При ферментации лактозы с образованием кислоты и газа дают положительный ответ на БГКП.

Результаты выражают в величинах коли-индекса.

Норматив. Индекс БГКП 1-10 клеток/г почвы

Метод мембраной фильтрации. Используют в качестве ускоренного метода. Применяют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм. Фильтруют 5,0-10,0 см³ почвенной суспензии первого разведения (1:10) через мембранные фильтры, сеют на дифференциальную питательную среду с лактозой, отбирают подозрительные колонии, идентифицируют бактерии по культуральным и биохимическим свойствам.

Метод прямых поверхностных посевов. Применяют при анализе загрязненных и сильно загрязненных почв.

На среду Эндо засевают по 0,1 или 0,2 см³ разведений почвы: от 10^-1 до 10^-3 для сравнительно чистых почв, из разведений до 10^-5 и 10^-6 для сильно загрязненных почв. Среды обычно используют подсушенные. Растирают посев шпателем. Инкубация посевов 37 ^оС 24 часа. Дальнейшая идентификация аналогична рассмотренной выше ( в титрационном методе, начиная со среды Эндо). Посчитывают количество колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашках, умножается на степень десятикратного разведения. Результаты выражают в количестве КОЕ/г.

Норматив. До 10 КОЕ/г

3.1.2.2. Определение энтерококков.

Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые с заостренными концами. В мазках располагаются парами или короткими цепочками, реже одиночно. При росте на жидких средах (лактозо-пептонная среда, ЛПС; щелочная элективная среда с полимиксином, ЩЭС) вызывают диффузное помутнение и образование осадка.

Для выявления энтерококков используют титрационный метод и метод мембранной фильтрации.

Титрационный метод применяют для анализа почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения.

Из разведений почвенной суспензии стерильной пипеткой берут 10 см³ и засевают во флаконы с 50 см³ жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют 24 час при 37 ^оС. При наличии признаков роста производят высев на плотные среды МИС (молочно-ингибиторная среда) или ЖСТ (желточная среда Турчинского). Инкубируют 24-48 часов. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.

При наличии аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест.

После выявления энтерококков устанавливают титр, при котором принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживают энтерококки. Для перевода титра в индекс, необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр.

Метод мембранной фильтрации.

Объем испытуемой пробы должен быть таким, чтобы не менее чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50.

Фильтруют 2-3 десятикратных объема испытуемой пробы. Фильтры помещают на азидную среду или ЖСТ и инкубируют 24-48 час при 37 ^оС.

Учет результатов на азидной среде.

На азидной среде выбирают фильтры, на которых выросло от 5 до 50 колоний. Посчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые, с ровными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным не четко оформленным центром. При необходимости 2-3 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по методу Грама.

Положительный ответ дают при обнаружении в мазках грамположительных полиморфных диплококков.

Учет результатов на среде ЖСТ.

Выбирают фильтры, на которых выросло не более 20-30 колоний. Посчитывают характерные для энтерококков колонии.

При обнаружении колоний другого вида – выпуклых белых мелких или ярко окрашенных, проводят микроскопию мазков, окрашенных по Граму и каталазный тест.

Положительный ответ выдают при наличии грамположительных полиморфных каталазоотрицательных диплококков.

Результаты выражают в индексах, для чего подсчитанное число колоний энтерококков суммируют и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

Для расчета индекса количество колоний энтерококков суммируют, умножают на 1000 и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

Норматив. Индекс энтерококков 1-10 КОЕ /г

Оценка степени эпидемической опасности почвы

Категория загрязнения почвы	Индекс БГКП	Индекс энтерококков	Патогенные бактерии, в том числе сальмонеллы
Чистая	1-10	1-10	0
Умеренно опасная	10-100	10-100	0
Опасная	100-1000	100-1000	0
Чрезвычайно опасная	1000 и выше	1000 и выше	0

4.1. Основные методы определения санитарно-показательных микробов в пищевых продуктах:

4.1.1. Определение МАФАМ (мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы).

По 1 см3 (1 г) исследуемого продукта или по 1 см3 исследуемого продукта в различных разведениях помещают в стерильные чашки Петри и заливают 12-15 см3 расплавленного и остуженного до 45 о С мясо-пептонного агара (МПА). Посевы инкубируют 72 час при 30 оС, после чего просматривают посевы и подсчитывают число выросших колоний на поверхности в глубине агара. Результаты выражают в КОЕ в 1 см3 (1г) продукта.

4.1.2. Определение БГКП (бактерии группы кишечной палочки).

К БГКП относят условно-патогенные бактерии родов Echеrichia, Citrobacter, Enterobacter и Klebsiella. БГКП выявляют двумя методами:

а) Качественный метод. К определенной навеске 1 см3 исследуемого продукта или 1 г исследуемого продукта в различных разведениях засевают в среду Кесслера. Посевы инкубируют 24 час при 37 оС. На следующий день делают высев петлей в 10 см3 среды Кесслера с лактозой и поплавком. Посевы инкубируют 24 час при 37 о С. Далее изучают характер роста. При обнаружении мути и газа в поплавке выдают ответ о выделении БГКП. При отсутствии газа в поплавке проводят дополнительное исследование путем высева на среду Эндо или Мак-Конки. Чашки инкубируют 24 час при 37 оС. Отмечают (при наличии) лактозаположительные колонии, которые отсевают на скошенный МПА. Инкубируют 24 час при 37 оС. Затем готовят мазки и определяют оксидазную активность у культуры. При обнаружении в мазках неспорообразующих грамотрицательных, оксидаза-отрицательных палочек выдают ответ об обнаружении БГКП в определенном объеме. При отсутствии помутнения и газообразования в среде Кесслера, выдают отрицательный ответ.

б) Количественным метод. Навеску продукта или его разведения, объеме 0,1 или 0,2 см3 поверхностно высевают на дифференциально-диагностические среды (VRBL агар, среды Эндо, Мак-Конки). Посевы инкубируют 24 час при 37 оС. Затем подсчитывают количество характерных колоний и производят их высев на скошенный МПА. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС. Из выросших колоний готовят мазки и окрашивают по Граму. При подтверждении наличия БГКП выдают результат об их количестве.

4.1.3. Определение бактерий рода Salmonella.

Бактерии рода Salmonella должны отсутствовать в 25 г (см3). Пробы засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37 оС. Затем делают высев по 1 см3 в 2 среды обогащения: RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) и Мюллера-Кауфмана тетратионатный (МКТ) бульон либо селенитовый бульон. Среду RVS инкубируют 24 часа при 41 оС, а селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана 24 часа 37 оС. Через 24 часа делают пересев на среды: XLD (ксилоза-лизин декстрозный агар) и Эндо или Левина, Плоскирева. Термостатируют 24 часа при 37 оС и учитывают характер роста (сальмонеллы образуют на средах Эндо, Левина, Плоскирева колонии S-формы бесцветные или розовые, а на XLD агаре — колонии с черным центром и прозрачной перифирической зоной красноватого цвета) и делают отсев на скошенный МПА и инкубируют 24 часа 37 оС. Через 24 часа ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле с поливалентными сальмонеллезными сыворотками А, В, С, D и Е. В случае положительной реакции ставят РА с групповыми сыворотками. Одновременно с РА материал засевают на среду Олькеницкого и изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. После инкубации (24 часа при 37 оС) определяют биохимические свойства. Сальмонеллы подвижны, не расщепляют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, образуют сероводород, не образуют индол. У выделенной чистой культуры бактерий изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. Для определения вида (серовара) сальмонелл используют РА с моновалентными О- и Н- сальмонеллезными сыворотками.

Обнаружение микроорганизмов, образующих характерные колонии на средах XLD и Эндо, имеющих характерные морфологические, биохимические и антигенные свойства, указывает на присутствие в исследуемом пищевом продукте сальмонелл.

4.1.4. Определение бактерий рода Proteus.

Исследуемый материал из различных разведений пищевого продукта высевают в конденсационную воду скошенного МПА (метод Шукевича). Посевы инкубируют 24 часа при 37 о С. Образование характерного ползучего роста на поверхности агара и наличие в мазках грамотрицательных подвижных палочек свидетельствуют о наличии протея.

4.1.5. Определение коагулазоположительных стафилококков.

Исследуемый пищевой продукт из различных разведений в количестве 1 см3 засевают в солевой бульон (6,5%) в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37 оС. Далее делают высев на ЖСА или МСА (молочно-солевой агар). Инкубируют 24 часа при 37 оС и при комнатной температуре. Изучают характер роста микроорганизмов: отбирают пигментированные, S-формы колонии с зоной лецитовителазной активности или без нее, готовят из них мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют (грамположительные кокки в гроздьях). Выделяют чистую культуру микроорганизмов, изучают наличие плазмокоагулирующей активности. На присутствие стафилококков указывает наличие грамположительных кокков, образующих пигментированные колонии S-формы, дающих положительную реакцию в тесте плазмокоагуляции.

4.2. Микрофлора молока и молочных продуктов

В молоко сапрофитная и патогенная микрофлора может попадать с вымени коровы, с рук доярок или доильного аппарата, а также в результате неправильной обработки, транспортировки или хранения. С кожи человека и животного в молоко попадают стрептококки, стафилококки и B. cereus. От больных людей и носителей попадают возбудители кишечных инфекции и пищевых токсикоинфекций. От больных животных человеку передаются возбудители туберкулеза, дизентерии, бруцеллеза, сальмонеллеза, ящура, сибирской язвы, Q лихорадки, клещевого энцефалита и др..

В сыром молоке, сохраняемом при комнатной температуре и в покое, можно наблюдать пять фаз развития микроорганизмов:

1) Бактерицидная фаза. Бактерицидные факторы молока (иммуноглобулины, лизоцим, лактоферин) задерживают развитие бактерий. Длительность этой фазы колеблется от 2 до 36 часов. Видимых изменений молока в этой фазе не наблюдают.

2) Фаза смешанной микрофлоры. Продолжается приблизительно 12 часов или несколько дольше. В этой фазе в молоке размножаются микроорганизмы, случайно попавшие в него. Видимых изменений продукта не наблюдают.

3) Фаза молочнокислых бактерий. Некоторые авторы различают в ней стадии размножения молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек. В первой усиленно размножатся молочнокислые стрептококки, расщепляющие молочный сахар с образованием молочной кислоты, что изменяет реакцию среды и создаёт неблагоприятные условия для развития гнилостных и щелочеобразующих бактерий. Продолжается этот период 48 часов, затем из-за кислой реакции среды развитие молочнокислых стрептококков задерживается, а молочнокислые палочки продолжают размножаться, так как они более устойчивы к условиям кислой среды. Однако при значительном снижении рН среды молочнокислые палочки также погибают. Молоко в этой фазе свёртывается и превращается в «простоквашу».

4) Грибковая или дрожже-плесневая фаза. В этот период происходит размножение молочной плесени и дрожжей, усваивающие молочную кислоту, что повышает рН среды и создает условия для размножения гнилостных микробов. При этом простокваша «зацветает».

5) Гнилостная фаза. В молоке размножаются гнилостные аэробные и анаэробные бактерии, пептонизирующие казеиновый сгусток, масляно-кислые микроорганизмы и другие, полностью разрушающие молоко.

При санитарно-микробиологическом исследовании молока в соответствии с ГОСТом и Техническим регламентом определяют:

1. Содержание мезофильных аэробных и факультативно – анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ). Количество МАФАМ выражают в КОЕ в одном см3 или одном г продуктов

2. Наличие БГКП

3. Наличие сальмонелл

4. Наличие стафилококков

5. Наличие листерий

6. Сортность молока (ставят пробу на редуктазу)

7. Ставят пробу на брожение

4.2.1 Определение содержания МАФАМ.

При исследовании пастеризованное молоко разводят стерильным физиологическим раствором в соотношениях 1:10; 1:100, 1:1000 и вносят по 1,0 см3 в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА, перемешивают и инкубируют трое суток при 30 оС, затем подсчитывают число выросших колоний по формуле:

X = n10m

где Х - количество МАФАМ в 1 см3

n - количество колоний

m – степень разведения

Норматив. Количество МАФАМ для пастеризованного молока в потребительской таре должно быть не должно превышать 105 КОЕ/см3.

4.2.2. Определение БГКП.

Пастеризованное молоко разводят физиологическим раствором в соотношении 1:10; 1:100 и засевают по 1 см3 в 3 пробирки со средой Кесслера с поплавками: В 1 пробирку вносят 1 см3 цельного молока; во 2 пробирку — 1 см3 из разведения 1:10 и в 3-ю — 1 см3 из разведения1:100. Термостатируют 18-24 часа при 37 оС. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразовании отмечают, что БГКП в нем обнаружены.

Норматив. БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3 пастеризованного молока.

4.2.3. Выявление сальмонелл.

По ГОСТу определения сальмонелл не проводят, но согласно СанПиН в 25 граммах продукта сальмонеллы должны отсутствовать. Поэтому выявление бактерий рода сальмонелл, необходимо проводить по ГОСТ Р 52814 – 2007. Пробы засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37оС. Затем делают высев по 1 см3 в 2 среды обогащения: RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) и тетратионатный бульон либо селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана). Среду RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) инкубируют 41 оС-24 часа, а селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана 24 часа 37 оС. Через 24 часа делают пересев на среды: XLD (ксилоза-лизин декстрозный агар) и Эндо, Левина или Плоскирева. Термостатируют 24 часа при 37 оС и учитывают характер роста (сальмонеллы образуют на среде Эндо колонии S-формы бесцветные или розовые) и делают отсев на скошенный МПА. Пробирки инкубируют 24 часа 37 оС.

Через 24 часа ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле с поливалентными сальмонеллезными сыворотками А, В, С, D и Е. В случае положительной реакции ставят РА с групповыми сыворотками. Одновременно с РА материал засевают на среду Олькеницкого и изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. После инкубации (24 часа 37 оС) отмечают характер роста микроорганизмов. Сальмонеллы подвижными, не расщепляют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, образуют H2S и не образуют индол. У выделенной чистой культуры бактерий изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород.

Для определения серовара сальмонелл используют РА с моновалентными О- и Н- сальмонеллезными сыворотками.Обнаружение микроорганизмов, образующих характерные колонии на средах XLD и Эндо, имеющих характерные морфологические, биохимические и антигенные свойства, указывает на присутствие в исследуемом пищевом продукте сальмонелл.

Норматив. Сальмонеллы должны отсутствовать в 25 см3 молока.

4.2.4. Выявление Staphylococcus aureus.

Проводят в соответствии с ГОСТом 303447 – 97 «Молоко и молочные продукты».

Определение S. аureus в определенном объеме продукта с предварительным обогащением. Из ранее приготовленных разведений, используем ту массу, в которой по нормативному документу S. aureus должен отсутствовать. Например: в молоке пастеризованном в потребительской таре наличие S. aureus не допускается в 1,0 см3.

Для выявления S. aureus 1 см3 цельного продукта вносят в пробирки с солевым бульоном (1:10), инкубируют при 24 часа 37 оС. Через 24 часа отсевают на среду Бэйрд – Паркера (ЖСА, МСА). Инкубируют 24-48 часов при 37ооС, готовят мазки и отсевают характерные колонии на МПА. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС, а затем ставят пробу на плазмокоагулазу.

Наличие характерных морфологических, культурных свойств и положительной реакции плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в определенном объеме.

Норматив: золотистых стафилококков не должно быть в 1см3 пастеризованного молока в потребительской таре.

4.2.5. Определение листерий.

Исследование включает несколько этапов:

1-й этап. Для определения листерий подготовленную навеску продукта (25 г/см3) вносят в среду для первичного обогащения в количестве 225 мл (ПБЛ 1 — питательный бульон для листерий) и инкубируют 24 часа при 37 оС.

2-й этап. Затем 0,1 см3суспензии из молока пересевают в 10 см3 среду вторичного обогащения (ПБЛ 2) и инкубируют 48 часов при 37 оС.

3-й этап. Через 48 часов из пробирок независимо от наличия или отсутствия признаков роста отсевают 0,1 см3 на поверхность двух чашек с ПАЛ (РАLСАМ) агаром инкубируют 24-28 часов при 37 С.

Примечание: допустимо не проводить второй этап (этап вторичного обсеменения) при посеве с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде первого этапа, т.е. переходить сразу к посеву на агаризованные среды.

4-й этап. Изучают характер роста: на среде PALCAM — через 24 часа листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм., иногда с черным центром. Через 48 часов их диаметр равен 1,0-2,0 мм.; колонии становятся зелеными с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая флора образует желтые колонии за счет ферментации маннита. Отобранные колонии (3-5) пересевают на МПА, дополненный 1% глюкозы. Посевы инкубируют посевы 24 часа при температуре 30 о С.

5-й этап. Включает:

а) микроскопию (грамположительные тонкие короткие палочки, спор не образуют).

б) определение каталазной активности (положительны)

в) определение подвижности посевом уколом на полужидкий агар PALCAM в 2 пробирки. Одну инкубируют при 25 оС, другую при 37 о С 48-72 часов. При 20-25 оС подвижны, характер роста напоминает зонтик; неподвижны при 35-37 оС.

г) определение способности восстанавливать нитраты.

д) определение ферментации углеводов. Проводят посев на пестрый ряд (не утилизируют маннит, ксилозу; утилизируют рамнозу с образование кислоты) при 37 о С в течении 7 дней.

е) Определение гемолитической активности на кровяном агаре (образует зону гемолиза вокруг колоний)

Норматив. Наличие листерии не допускаются в 25 г или см3 продукта.

4.2.6. Определение редуктазной активности.

Проводят при исследовании сырого молока. Метод основан на способности восстанавливать метиленовый голубой ферментами, выделяемыми микроорганизмами, присутствующими в молоке. По продолжительности изменения окраски оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Чем медленнее процесс, тем меньше микроорганизмов в молоке, тем лучше его качество.

4.2.7. Проба на брожение.

Применяют при определении пригодности молока для производства сыра. Метод основан на способности некоторых микроорганизмов, присутствующих в молоке, свертывать его. Чем медленнее происходит образование сгустка без выделения сыворотки и пузырьков газа, тем лучше качество молока.

4.3. Исследование кисломолочных продуктов

При проведении исследований определяют наличие БГКП, сальмонелл, стафилококков, дрожжей, плесеней и качество вложения закваски; определение МАФАМ не проводят. Из неразведенного материала готовят мазки, окрашивают метиленовым голубым и микроскопируют. В мазках должны обнаруживаться представители специфической микрофлоры. В простокваше, кефире и йогурте — молочнокислые стрептококки и палочки. В ацидофильной пасте — молочнокислые палочки. В твороге и сметане — молочнокислые стрептококки.

4.4. Микрофлора мяса и мясных продуктов

Мышцы животного в норме не содержат микробов. Обсеменение происходит при забое животного, разделке туши и измельчении мяса. Гниение мяса вызывают аэробные микроорганизмы (протеи, кишечные и сенные палочки) и анаэробные микроорганизмы (клостридии), кислое брожение вызывает кислотообразующие бактерии. Плесневение мяса вызывают грибы. Патогенные бактерии попадают в мясо при жизни животного (интравитально) или же после его смерти (постмортально).

Для предупреждения передачи инфекционных болезней проводят ветеринарный контроль животных перед забоем и санитарно – микробиологическое исследование мяса, мясопродуктов и готовых изделий из мяса, предназначенных в пищу.

При исследовании туши берут кусочки мышц, лимфатических узлов, долю печени с желчным пузырем, почку, селезенку, трубчатую кость, пораженные участки органов.

4.4.1.Для исследования мяса согласно требованиям ГОСТа (21237-75-87-92 - Мясо. Методы бактериологического анализа) используют бактериоскопические (включая иммунолюминесцентную микроскопию), бактериологические, серологические (например, для определения антигенов возбудителя сибирской язвы в реакции Асколи), биологические (например, биопробы для определения возбудителей сибирской язвы и анаэробных инфекций, а также для определения ботулотоксина) методы:

4.4.1.1.Свежесть мяса определяют по органолептическим, физико-химическим показателям и микроскопическому исследованию.

Для бактериоскопического исследования из мяса готовят 2-10 мазков-отпечатков из перечисленных органов, окрашивают их по Граму, 2-х процентным раствором сафранина и раствором Ребигера (для выявления капсулы).

Мясо считают свежим, если в мазках-отпечатках, окрашенных по Граму, микроорганизмы отсутствуют или имеются единичные бактерии, а также нет признаков распада мышечной ткани.

При микроскопии мазков обращают внимание на наличие возбудителя сибирской язвы. При обнаружении грамположительных палочек с обрубленными концами и ли капсулированных стрептобацилл в мазках окрашенных специфическими методами, дальнейшее исследование проводят только на обнаружение сибиреязвенных палочек.

При определении подозрительных стрептобацилл проводят реакцию термопреципитации по Асколи для обнаружения сибиреязвенного антигена.

Если в мазках не обнаружены сибиреязвенные палочки, то проводят бактериологическое исследование (для выявления других возбудителей инфекционных заболеваний).

4.4.1.2. Бактериологическое исследование. Из представленных образоц готовят две навески весом 15 г (одну из мяса и лимфатических узлов, другую из внутренних органов – печени, почки, селезенки), разводят навески в 15 см3 физиологического раствора и гомогенизируют. Полученный материал сеют петлёй на следующие среды:

1. На МПА для определения возбудителя сибирской язвы, рожи свиней, листериоза, пастереллёза и группы кокков. Посевы инкубируют 24 часа при 37 о С

2. На Эндо, Левина для определения микробов семейства кишечных. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС

3. На Китта-Тарроции для выявления анаэробных бактерий, возбудителей столбняка, ботулизма, дизентерии ягнят, некробиоза и т.д. Посевы инкубируют при 37 оС 5-10 суток.

Со всех сред выделяют чистые культуры микроорганизмов, которые идентифицируют по биохимическим и антигенным свойствам.

4.4.1.3. Иммунолюминесцентная микроскопия. Применяют для выявления сальмонелл и возбудителей рожи свиней. Для этого из мяса готовят мазки-отпечатки и обрабатывают их флюоресцирующими сыворотками. Такие же исследования можно провести с выделенными чистыми культурами микроорганизмов.

4.4.2. Исследование мяса по СанПин

При санитарно-микробиологическом исследовании мяса определяют:

— наличие МАФАМ

— наличие БГКП

— наличие сальмонелл

— наличие листерий

4.4.2.1. Для определения МАФАМ делают разведения из расчета 1:10, 1:100 и 1:1000. Для этого 10 г продукта вносят в 90 см3 физиологического раствора (1:10). Из него готовят разведения 1:100 и 1:1000. Затем из каждого разведения по 1 см3 сеют в 2 стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС. Затем делают подсчет выросших колоний, учитывая разведение.

Норматив: количество МАФАМ должно быть не более 10 КОЕ/г.

4.4.2.2. Для определения количества БГКП 10 см3 исходной взвеси (1 г продукта) сеют на среду Кесслера. Дальнейшие исследования проводят по методу, указанному выше (4.1.2).

Норматив: БГКП – не должны обнаруживаться в 1 г продукта.

4.4.2.3. Для определения сальмонелл делают посевы по обычной схеме (4.1.3).

Норматив – сальмонеллы не должны определяться в 25 г мяса.

4.4.2.4. Для определения листерий делают посевы по обычной схеме (4.2.5).

Норматив: листерии не должны определяться в 25 г мяса.

4.4.3. Санитарно-микробиологическое исследование полуфабрикатов и готовых изделий из рубленого мяса

Для исследования отбирают несколько образцов из каждой партии продуктов. Из них отбирают несколько кусочков из внутренних и наружных частей каждого изделия всего 5 г, добавляют 45 мл физиологического раствора и готовят гомогенат (1:10), для посева используют надосадочные слои жидкости, в которых определяют присутствие МАФАМ, .БГКП, бактерии родов Salmonella и Proteus.

4.4.3.1. Для выявления МАФАМ по 1,0 см3 из разведений 1:100, 1:1000 засевают на чашки глубинно, заливают расплавленным и остуженным до 50 оС МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС, затем подсчитывают количество выросших колоний, выражая результат в КОЕ/г.

4.4.3.2. Для выявления БГКП 1,0 см3 исследуемой взвеси из разведения 10-4 высевают на среды Хейфеца или Кесслера, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.2).

4.4.3.3. Для выявления бактерий рода Salmonella кусочки весом 25 г первоначально засевают на забуференную пептонную воду, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.3.).

4.4.3.4. Для выявления бактерий рода Proteus 0,5 см3 из разведения 1:10 сеют в пробирку со скошенным МПА (посев по Шукевичу). Инкубируют посев при 37оС 18-20 часов. Дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.4)

4.4.3.5. Для определения листерий делают посевы по обычной схеме (4.2.5).

Норматив: количество МАФАМ в исследуемом продукте не должно превышать 5•106 КОЕ /г; наличие БГКП, сальмонелл, протеев и листерий в исследуемых объемах не допустимо.

4.4.4. Санитарно-микробиологическое исследование

колбасных изделий и продуктов из мяса

Изделия в оболочке обжигают с поверхности, разрезают, отбирают образцы с наружной и внутренней части продукта, готовят гомогенат (20 г колбасы и 80 см3 физиологического раствора) и сеют на среды. Определяют присутствие МАФАМ, БГКП, сальмонелл, протеев, коагулазоположительных стафилококков и сульфит-восстанавливающих клостридий.

4.4.4.1. Для определения МАФАМ по 1,0 см3 из разведений 1:10 и 1:100 высевают на 2 чашки и заливают расплавленным и остуженным до 45 о С МПА. Инкубируют 72 часа при 30 о С. Дальнейшее исследование проводят как описано выше(4.1.1).

4.4.4.2. Для определения БГКП 5,0 см3 гомогената сеют на среду Кесслера, инкубируют 18 –20 часов при 37 оС. Дальнейшее исследование проводят как описано выше(4.1.2).

4.4.4.3. Для определения сальмонелл 25 г продукта засевают на забуференную пептонную воду, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.3).

4.4.4.4. Для определения коагулазоположительных стафилококков 5 см3 из исходного разведения высевают на солевой бульон и инкубируют 24 часа при 37 оС. Дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.5).

4.4.4.5. Для выявления бактерий рода Proteus 0,5 см3 исходной взвеси сеют в пробирку со скошенным МПА (посев по Шукевичу). Инкубируют посев при 37оС 18-20 часов. Дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.4)

4.4.4.6. Для определения сульфит-восстанавливающих клостридий по 1,0 см3 из разведения 10 1 -10-7 высевают на среду Уилсона-Блэра, инкубируют 8-12 часов при 46 оС. При наличии клостридий происходит почернение и разрывы среды. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают грамположительные палочки.

Норматив: в вареной колбасе количество МАФАМ не должно превышать 1х103 КОЕ /г , остальные микроорганизмы не должны обнаруживаться в исследуемых объемах.

4.5. Санитарно-бактериологическое исследование рыбы

В норме мясо рыб не содержит микроорганизмов. Бактерии попадают в мышцы после смерти рыбы из жабер, кишечника и кожных покровов. В процессе разделки рыбы и при кулинарной обработке обсеменение мяса рыб может значительно возрастать. Икра рыб, извлеченная асептически, как правило, стерильна. Порчу рыбы вызывают микроорганизмы. Гнилостное разложение рыбы может быть связано с размножением в ней психрофильных бактерий, поэтому рыба может портиться даже в условиях холодильника. Через мясо рыбы и рыбные изделия передаются сальмонеллы, галофильные вибрионы, ботулотоксины, энтеротоксины золотистого стафилококка. Также возможно отравление биогенными аминами, образующимися в результате при разложении мяса рыб протеями. Для оценки санитарно-бактериологического состояния рыбы проводят определение наличия МАФАМ; БГКП, коагулазоположительных стафилококков, патогенных энтеробактерий, в том числе сальмонелл.

Для исследования отбирают куски рыбы, расположенные ближе к голове, весом 150-200 г. Мелкую рыбу в количестве 100 г, отбирая целиком. Образцы помещают в стерильную посуду и направляют в лабораторию.

4.5.1. Определение МАФАМ. Навеску рыбы, равную 15 г растирают в ступке с 135 см3 физиологического раствора, т.е. получают разведение 1:10 из которого готовят разведение 1:100. По одному см3 взвеси из разведений 1:10 и 1:100 вносят в две стерильные чашки и заливают расплавленным и остуженным МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС. Затем подсчитывают число выросших колоний, и делаю пересчет на разведение.

4.5.2. Определение БГКП: 10 см3 взвеси из разведения 1:10 засевают в 50 см3среды Кесслера. Посевы инкубируют 18-24 часа 37 оС. Дальнейшие исследования проводят по обычной схеме (4.1.2).

4.5.3. Определение коагулазоположительных стафилококков: 10 см3 взвеси из разведения 1:10 засевают в 50 см3 солевого бульона. Посевы инкубируют 18-24 часа при 37 оС. Дальнейшие исследования проводят по обычной схеме (4.1.5).

4.5.4. Определение патогенных энтробактерий, в том числе сальмонелл. Производят высев 25 г продукта на забуференную пептонную воду, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.3).

Нормативы: Количество МАФАМ для жареной рыбы не должно превышать 1 х 104 КОЕ/г. Присутствие в посевных объемах БГКП, стафилококков, патогенных энтеробактерий, включая сальмонеллы, недопустимо.

4.6. Санитарно-микробиологическое исследование напитков

4.6.1. Санитарно-микробиологическое исследование воды для изготовления безалкогольных напитков.

Вода, применяемая для изготовления безалкогольных напитков, должна, по качеству, соответствовать питьевой. В готовые напитки (бутылочную и разливную воду) может попасть посторонняя микрофлора, которая вызывает помутнение напитков и образование осадка. Насыщение углекислотой и кислая реакция напитка не гарантирует подавления размножения болезнетворных микробов.

Перед исследованием воды пробку бутылки обтирают спиртом, вскрывают фламбированным (стерилизованным в пламени) ключом. Затем фламбируют горлышко бутылки. Из бутылки отбирают необходимый для исследования объем жидкости. Образец помещают в стерильную колбу, закрывают ватно-марлевой пробкой. Отобранную пробу ставят для дегазации на водяную баню и выдерживают 1 час при 43 оС. Перед посевом рН напитка доводят до 7,0 с помощью 10%-го раствора Na2CО3 и проверяют с помощью индикаторных бумажек.

В питьевой минеральной воде определяют наличие МАФАМ, БГКП и Pseudomonas aeruginosa.

4.6.1.1. Определение МАФАМ и БГКП проводят по МУК «Вода питьевая».

4.6.1.2. Для определения P. aeruginosa из всех объемов лактозопептонной среды при посеве воды бродильным методом делают высев на среду Эндо. В случае наличия на питательной среде колоний с запахом жасмина, делают отсев подозрительных микроорганизмов на скошенный МПА и проводят их идентификацию по биохимическим свойствам. Количество P. aeruginosa определяют по таблице расчета наиболее вероятного числа (НВЧ).

Нормативы для минеральной воды: МАФАМ не более 100 КОЕ/см3, БГКП и синегнойная палочка не должны присутствовать в100 см3

4.6.2. Санитарно -микробиологическое исследование кваса

Квас является продуктом спиртового и молочно-кислого брожения. Различают хлебный, плодово-ягодный и другие квасы. Микрофлора их разнообразна и многочисленна, содержание молочной кислоты в хлебном квасе достигает 0,6 % , спирта — 1%. В связи с этим квас является неблагоприятной средой для размножения кишечной палочки и патогенных микробов семейства Enterobacteriaceae. Попадание этих микробов в квас возможно при нарушении санитарного режима производства, при использовании плохо помытых бутылок, через загрязненные руки рабочих и через посуду при разливе кваса.

При проведении санитарно-бактериологического исследования кваса определяют наличие БГКП; патогенных энтеробактерий, в том числе сальмонелл.

4.6.2.1. Для определения БГКП при исследовании хлебного кваса приготовленного на чистых культурах микроорганизмов 1,0 см3 разливного кваса сеют на среду Кесслер, инкубация посевов 37 оС 24 часа. Дальнейшие исследования проводят по обычной схеме (4.1.2)

4.6.2.2. Для определения патогенных энтеробактерий, в том числе сальмонелл, 25,0 см3 кваса сеют на забуференную пептонную воду. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС. Дальнейшие исследования проводят по обычной схеме (4.1.3).

Нормативы для разливного кваса: БГКП не должны определяться в 1,0 см3, патогенные энтеробактерии должны отсутствовать в 25,0 см3

4.6.3. Санитарно-микробиологическое исследование пива

Для изготовления пива ячменно-хмельное сусло сбраживают дрожжами, затем для удаления их пиво фильтруют. Присутствие в пиве небольшого количества спирта (1,8-7 %), ферментов, кислот и углекислоты не дает возможности размножаться посторонней микрофлоре, которая может попасть в пиво в случае изготовления его на загрязненной воде и при нарушении санитарного режима на производстве и при реализации пива.

В пиве определяют наличие БГКП, патогенных энтеробактерий, в том числе сальмонелл.

4.6.3.1. Для определения БГКП 10,0 см3 непастеризованного пива в бутылках и 1,0 см3 разливного пива сеют на среду Кесслера, посевы инкубируют 24 часа при 37 оС. Дальнейшие исследования проводят по обычной схеме (4.1.2)

4.6.3.2. При определении патогенных энтеробактерий, в том числе сальмонелл, 25,0 см3 пива засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС . Дальнейшие исследования проводят по обычной схеме (4.1.3).

Нормативы для пива: БГКП не должны обнаруживаться в непастеризованном бутылочном пиве в10 см3 , а в разливном в 1,0 см3. Патогенные микробы семейства Enterobacteriaceae не должны обнаруживаться в 25 см3 пива.

4.7. Санитарно-микробиологическое исследование консервов

При оценке санитарно-бактериологического состояния консервов определяют промышленную стерильность и наличие патогенной и токсигенной микрофлоры по эпидемиологическим показателям. Под промышленной стерильностью понимают отсутствие в консервах микроорганизмов, способных развиваться при температуре хранения, установленной для данного вида консервов, патогенных микробов и их токсинов.

4.7.1. Отбор проб. При санитарно-эпидемиологическом анализе консервов от каждой партии отбирают не менее трех единиц потребительской тары.

Консервные банки могут иметь три основных дефекта:

1. Бомбаж — наличие вздутий крышек и дна, не опадающих при нажиме;

2. Хлопуша — вздутие дна или крышки банки, опадающие при нажиме пальцев руки. При этом вздувается противоположный конец банки, а после снятия давления вновь вздувается первоначальный участок с характерным звуком;

3. Банки с вибрирующими концами — консервы в нормальной по внешнему виду таре, при нажиме на которую происходит выпячивание противоположного конца, возвращающегося в нормальное состояние после снятия нажима.

На исследование отбирают из нормальных по внешнему виду консервов 1 единицу из каждых пятисот, но не менее трех и не более пятидесяти.

Перед исследованиями банки моют водой с мылом или детергентом, швы протирают щеткой, ополаскивают водой и высушивают. Затем проверяют банки на герметичность. Для этого их помещают в сосуд с водой, нагретой до кипения, и выдерживают 5-7 минут. Слой воды над банками должен быть не менее 25-30 мм, а температура воды не менее 70-80 оС. Если банки не герметичны, то в воде появятся пузырьки газа. Бактериологическому исследованию на промышленную стерильность подлежат лишь герметичные банки.

Бездефектные по внешнему виду консервы, предназначенные для определения промышленной стерильности, перед исследованием термостатируют (ставят контроль на бомбаж). Для обнаружения мезофильных микроорганизмов консервы объемом до 1 л термостатируют 5 суток при 37 оС , объемом более 1 л — 7 суток. Для определения термофильных микробов консервы любого объема термостатируют не более 3-х суток при 55 оС. Затем их выдерживают 24 часа при комнатной температуре, после чего просматривают и используют для исследований.

Вскрытие консервов и их бактериологическое исследование проводят в специальном боксе. Перед вскрытием банки несколько раз переворачивают для тщательного перемешивания. Затем крышку обрабатывают стерильным тампоном, смоченным спиртом. Тампон оставляют на крышке и поджигают. В непосредственной близости от тампона пробойником делают проколы, расширяя отверстия до 1-3 см.

Отбор навесок производят немедленно. Масса навески должна быть не менее 10 г или см3. Из навески при необходимости готовят разведение, используя стерильный физиологический раствор.

4.7.2. Определение промышленной стерильности консервов:

1. Для определения наличия мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов производят посев по 1 см3 образца в две пробирки с МПБ и глюкозой. Посевы инкубируют 5 суток при 30 оС.

2. Для определения наличия мезофильных анаэробных микроорганизмов по 1 см3 образца засевают глубинно на дно двух пробирок со средой Китта-Тароцци и инкубируют 5 суток. при 30 оС.

3. Для определения наличия термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов по 1 см3 образца высевают в две пробирки с картофельно-пептонной средой. Посевы инкубируют 3 суток при 55-62 оС.

4. Для определения наличия термофильных анаэробных микроорганизмов по 1 см3 образца засевают глубинно на дно двух пробирок со средой Китта-Тароцци и инкубируют 3 суток при 55-62 оС.

Затем изучают посевы и при отсутствии роста дают заключение о том, что данные микроорганизмы не обнаружены (консервы промышленно стерильны). В случае наличия роста микробов выделяют чистые культуры, изучают их свойства и идентифицируют.

Норматив: Наличие в консервах аэробной и факультативно анаэробной неспорообразующей микрофлоры указывает на недостаточную эффективность применяемых методов стерилизации и возможности их порчи. Присутствие сапрофитных аэробных бацилл является допустимым при герметичности консервных банок.