Глава 2. Методы оценки состояния и динамики
биоразнообразия на разных иерархических уровнях
организации биосистем
2.1. Биофизические и биохимические методы
2.1.1. Биолюминесценция
Биолюминесценция (от био и лат. lumen – свет, + -escent – суффикс, означающий слабое действие) широко распространена в природе и известна у бактерий, грибов, представителей разных типов животных – от простейших до хордовых. Биолюминесценция – это видимое свечение живых организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности и обусловленное у значительного числа видов ферментативным окислением особых веществ – люциферинов. У многоклеточных организмов (ракообразных, насекомых, рыб и др.) свечение часто обусловлено симбиотическими бактериями. Свечение может испускать вся поверхность тела или специальные органы. Продолжительность свечения варьирует от длительного, продолжающегося часы, до коротких вспышек, измеряемых у некоторых организмов долями секунды. Свет при биолюминесценции самых разных тонов – от голубого до красного. Биолюминесценция представляет собой один из типов хемилюминесценции: в ходе химической реакции выделяется энергия, которая не теряется в виде тепла и не сопряжена с какими-либо реакциями синтеза, а превращается в энергию электронного возбуждения молекул, способных выделять ее в виде фотонов. Как известно, хемилюминесцентные методы диагностики отличаются особой чувствительностью и представляют собой разновидность каталитических методов анализа, когда продукт реакции обладает хемилюминесцентными свойствами. Учет фонового свечения при этом проводят, анализируя пробы воды, предварительно обработанные каталазой, а также пробы с «внутренним стандартом» (малыми добавками Н2О2).
Механизм биолюминесценции связан с окислением люциферина при участии фермента люциферазы. Энергия, необходимая для активации люциферин – люциферазной системы, освобождается при гидролизе АТФ, как правило, в присутствии кислорода. Люциферины и люциферазы у различных биологических видов не идентичны.
Для целей биодиагностики используют различные светящиеся организмы, измеряя специальными приборами изменение интенсивности свечения под действием токсикантов [Данилов, Егоров, 1985]. Наиболее часто в качестве биоиндикаторов используют морские люминесцентные бактерии. Морские люминесцентные бактерии легко культивируются и оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за поддержание гомеостаза (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат) с быстрым, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие ксенобиотиков. Объективный характер отклика обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат особую люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений. Отклик люминесцентных бактерий на токсические вещества достоверно коррелирует с таковым у других биологических организмов, а величина 50% тушения свечения (ЕС50) достоверно коррелирует с величиной 50% летальной дозы (LD50) для человека.
Для целей биодиагностики используют обычно специальные люминесцентные реагенты (биосенсоры) приготовленные на основе живых культур светящихся организмов или на основе выделенных люциферин-люциферазных комплексов. Интенсивность свечения измеряется специальными приборами люминометрами. Введение в реакционную смесь пробы с токсическим соединением вызывает спад свечения (рис. 2.1.1).
Уровень тушения биолюминесценции пропорционален концентрации токсических веществ. Специальная светорегистрирующая аппаратура позволяет измерять интенсивность свечения реагента до и после введения неизвестного токсиканта в образце небольшого объема (0,2–0,5 мл). Время анализа, который можно проводить в полевых условиях, обычно не превышает нескольких минут.
Ввод образца
С
I0
В
Е
Ч
Е
Н
I
И
Е
0
1 2 3 t, мин .
Рис. 2.1.1.
Биосенсор интегрирует эффекты смесей токсикантов, обеспечивая определение общего индекса токсичности образца. Методы биолюминесценции предпочтительны в качестве первичных тестов и способны быстро ответить на вопрос: присутствуют или нет в среде токсические агенты в концентрации, опасной для человека и других живых организмов. Если промышленное предприятие выбрасывает во внешнюю среду преимущественно один тип токсического вещества, ответ биосенсора позволяет судить о концентрации данного соединения, и тогда отпадает необходимость в дополнительных методах анализа [Методические рекомендации, 1996, 2000].
Биолюминесцентные методы обладают хорошей чувствительностью к разнообразным химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (тяжелые металлы, фенолы, формальдегид, пестициды и т. д.).