Методические указания к выполнению работы

Все шаровидные и палочковидные бактерии, за исключением Sarcina flava, просматривают на фиксированных и окрашенных препаратах. Исследование бактерий в окрашенном препарате дает возможность не только изучить их морфологию, но и получить достоверное представление о некоторых деталях их химического сторения. Это достигается применением специальных окрасок.

Техника приготовления препаратов. Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле водопроводной воды и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют. Самый простой и распространенный способ — фик­сация жаром. Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки. Во избежание пере­грева препарата время фиксации не должно превышать 5—6 с, а время прямого воздействия пламени — 2с. Кроме жара, для фикса­ции могут быть применены следующие вещества.

1. Этиловый 95% спирт. Время фиксации 10—15 мин.

2. Смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира (по Никифорову) — 10—15 мин.

3. Метиловый спирт — 2—3 мин..

4. Ацетон — 5 мин.

5. 1% раствор сулемы — 10—15 мин и затем промывание препарата раствором NaС1 и водой.

6. 10% раствор АqNО3 -— 10 мин.

7. Жидкость Буэна: формалина неразбавленного 10 мл, ледяной уксусной кислоты 2 мл и насыщенного водного раствора пикриновой кислоты 30 мл.

8. Жидкость Карнуа: ледяной уксусной кислоты 10 мл, хлоро­форма 30 мл и 96% спирта 60 мл.

Методы окраски микробов разнообразны и многочисленны. Способы окраски препаратов в ос­новном можно разделить на две группы: ориентировочные простые окраски и окраски дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности бактерий.

Ориентировочная окраска.

Ориентировочная окраска бактерий, выявляющая только их морфологию, хорошо удается: 1) разведенным (1 : 10) карболовым фуксином — 10—30 с; 2) синим Леффлера — 3—10 мин; 3) спиртово-водным раствором метиленового синего — 3—5 мин; 4) водным раствором метиленового синего — 5—10 мин.

Спиртово-водный раствор метиленового синего: красителя 1 г, 95% спирта 10 мл, дистиллированной воды 100 мл. Водный раствор метиленового синего дает нежные отчетливые препараты: красителя 1 г, дистиллированной воды 1000 мл.

Щелочной раствор метиленового синего Леффлера — стойкий и хорошо красящий раствор: 1) дистиллированной воды 100 мл, 10% раствора едкого кали 2 капли, насыщенного (7%) раствора метиленового синего 30 мл или 2) метиленового синего 3 г, 95% спирта 20 мл, 1 % раствора едкого кали 1 мл, дистиллированной воды 100 мл.

Дифференциальная окраска

Наиболее употребительной среди дифференциальных окрасок является окраска по Граму. При этом методе выявляется способ­ность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой микробной клетки.

Карболовый раствор генцианового фиолетового или кристалли­ческого фиолетового: 1) красителя 1 г, 96% спирта 10 мл, кристал­лической карболовой кислоты 2 г, дистиллированной воды 100 мл (растирают в ступке краситель с карболовой кислотой до консистен­ции кашицы, прибавляют небольшими порциями спирт и оконча­тельно разводят водой, сливают в бутыль, оставляют на сутки, за­тем фильтруют) или 2) насыщенного (4,8%) спиртового раствора красителя 10 мл, 2% карболовой воды 100 мл.

Раствор Люголя (в модификации Грама): йодида калия 2 г, дистиллированной воды 10 мл, йода кристаллического 1 г. Смесь хорошо укупоривают, оставляют на сутки, после чего добавляют дистиллированной воды 300 мл.

Методика окраски по Граму. На фиксированный ма­зок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее нали­вают карболовый раствор генцианового фиолетового на 1—2 мин. Сливают краситель и, не смывая, наливают раствор Люголя на 1 мин. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в 95% спирте в течение 1/2—1 мин, пока не перестанет отходить кра­ситель. Промывают водой. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1—2 мин. Краситель сливают, препарат про­мывают и высушивают.

Видоизменение окраски Грама по А. И. Сине­ву. Заготовляют полоски фильтровальной бумаги, пропитанной 1% спиртовым раствором кристаллического фиолетового и высушенной. На препарат накладывают полоску такой бумаги (немного меньше предметного стекла) и наливают 2—3 капли воды. Окрашивают в течение 2 мин. Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1 мин. Обесцвечивают спиртом. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином.

Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в розовый и красный.

Окраска капсул. Окраска капсул микробов может иногда иметь диагностическое значение. В мазках из органов или из тканей кап­сулы можно обнаружить при помощи простой окраски щелочным или другими растворами метиленового синего. Однако специальные окраски дают более четкие препараты.

Окраска по Бурри. На середину предметного стекла на­носят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, кап­сулы.

Окраска по Ольту. Готовят 2% раствор сафранина в горячей воде и фильтруют его. Фиксированный мазок окрашивают сафранином при подогревании в течение 1—2 мин. Промывают, вы­сушивают. Препарат рассматривают в воде: на мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, на него наносят иммерсионное масло. Тело бактерии и капсула различно преломляют лучи света. Эта разница усиливается при прохождении луча через слой воды. Тела микробов окрашиваются в коричнево-красный цвет, капсулы — в бледно-желтый.

Способ Михина. Мазок готовят обычным способом, окрашивают раствором метиленового синего в течение 2-3 минут, подогревая до появления паров. Краску быстро смывают водой, мазок просушивают фильтровальной бумагой. Капсулы окрашиваются в светло-розовый цвет, бактерии – в темно-синий.

Окраска по Гинсу. Мазок, окрашенный тушью по Бурри, фиксируют сулемой, метиловым спиртом или на пламени. После промывания водой красят 5—10 мин карболовым раствором тионина или фуксина и вновь промывают, а затем высушивают. Бактерии фиолетовые или красные. Фон черный. Капсулы неокрашенные.

Окраска спор. Препарат, приготовленный обычным спосо­бом, при нагревании окрашивают 1—2 мин карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2% раствор азотной кислоты в спирте или в 1 % водный раствор серной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было вид­но следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают вод­ным раствором метиленового синего. Споры окрашиваются в крас­ный цвет

Окраска жгутиков. Это одна из наиболее трудных процедур в бактериологической технике, так как жгутики очень легко поврежда­ются при приготовлении препарата. Поэтому здесь требуется осо­бая тщательность работы. Стекла для препаратов должны быть аб­солютно чисты и обезжирены. Обычно работают с новыми покров­ными стеклами, которые предварительно кипятят в течение 10 мин в хромовой смеси (двухромовокислого калия 20 г, воды 200 мл, серной кислоты 20 мл; приливать в указанном порядке). После кипячения стекол хромовую смесь сливают, промывают стекла 5 мин в слабом растворе едкого натра, после чего обильно промывают водой, опо­ласкивают спиртом и хранят в спирте (во время промывания не касаться стекол руками). Перед употреблением стекла вынимают из спирта чистым пинцетом и удаляют спирт обжиганием (ничем не вытирать!).

Исследуемая культура должна быть не старше 12—18 ч. Мате­риал берут осторожным прикосновением петли к культуре и вносят в пробирку с несколькими миллилитрами водопроводной воды, погру­жая петлю в воду и держа ее неподвижно некоторое время. Повто­ряют это 2—3 раза, пока не получится тонкая, лишь слегка опалесцирующая взвесь. Полученной взвеси дают постоять 15—20 мин в термостате для равномерного распределения микробов в воде. Затем петлей переносят каплю на покровное стекло. Если стекло достаточно чисто, капля принимает правильную круг­лую форму, легко расплывается и быстро высыхает на воздухе без подогревания. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специ­альными способами, причем перед окраской обрабатывают протра­вой, которая усиливает действие краски.

Окраска включений в бактериях. Окраска по Мейеру. Одновременно из исследуемых бак­терий готовят два одинаковых препарата и фиксируют жаром или в течение 5—15 мин в жидкости Карнуа. Красят оба мазка 10 мин метиленовым синим Леффлера и затем один из них помещают в 1% водный раствор серной кислоты, другой — в 4% водный рас­твор карбоната калия. Через 5 мин препараты сушат фильтроваль­ной бумагой (не промывать!). Препарат, обработанный кислотой, до­крашивают 0,25% раствором светлого зеленого (лихтгрюн) с 2— 3 каплями крепкой уксусной кислоты или хризоидином. Бактерии окрашиваются в зеленый или коричневый цвет, зерна волютина — в вишнево-красный. В препарате, обработанном щелочью, волютин обесцвечен — пустоты на фоне слабо окрашенных бактерий.

Окраска по Раскиной. На препарат наливают краситель, состоящий из карболового фуксина Циля — 4 мл, насыщенного раствора метиленового синего — 4 мл, ледяной уксусной кислоты — 5 мл, 95% спирта — 95 мл, дистиллированной воды — до 200 мл. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта, а затем про­мывают водой и высушивают. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина — в черно-синий.

Для выявления подвижности клеток микроорганизмов. изучения размеров клеток, характера их расположения , определения запасных веществ в клетке, наблюдения за размножением и т.д. окрашивание объекта проводят « прижизненными красителями» - витальная окраска ( метиленовым синим, нейтральным красным в концентрации от 1/ 1000 до 1/ 10000 % .Окрашивание живых клеток микроорганизмов очень трудоемкий процесс, поэтому используется редко.

Как отмечалось ( см. лабораторную работу №1) известны два метода изучения живых клеток микроорганизмов - раздавленной и висячей капли. В обоих случаях препараты микроскопируют используя конденсор; поступление света регулируют вогнутым зеркалом. Вначале просматривают препараты при малом увеличении (8х), а обнаружив край капли, переходят на объектив 40х или иммерсионный (90х).

Исследование подвижности микробов в висячей капле. Для приготовления висячей капли исследуемый материал наносят на середину обезжиренного покровного стекла. Затем берут предметное стекло с луночкой, на края луночки наносят тонкий слой вазелина, и стекло, повернув луночкой вниз, прикладывают к по­кровному так, чтобы капля находилась в центре углуб­ления. Предметное и покровное стекла переворачивают, и капля оказывается герметически закрытой во влажной камере и защищенной от высыхания.

В качестве материала для исследования на подвижность используют молодые (6—12—18-часовые, но не старше односуточных) бульонные культуры. Можно брать и молодые агаровые культуры. Для этого предварительно приготавливают суспензию на стерильном фи­зиологическом растворе или в стерильной водопровод­ной воде. Для исследования под микроскопом сужают диафрагму и находят край капли с сухой слабой (8^Х) системой объектива. Найденную каплю передвигают в центр поля зрения и рассматривают с иммер­сионным объективом. В данном случае поступают следующим образом: на поверхность покровного стекла наносят каплю кедрового масла: иммерсионный объек­тив опускают под контролем глаза сбоку на препарат в каплю кедрового масла и слегка ее раздавливают (не допускают, чтобы объектив касался покровного стекла), а затем, наблюдая в окуляр, медленно поднимают тубус микроскопа до получения ясного изображения.

Исследование подвижности микробов в раздавленной капле. Для приготовления препарата раздавленная капли на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую бактериологической петлей вносят микробную культуру и растирают в суспензию, после чего накры­вают ее покровным стеклом так, чтобы в жидкости не образовывалось пузырьков воздуха.

Капля исследуемого материала должна быть неболь­шой, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под покров­ного стекла, избыток жидкости удаляют фильтроваль­ной бумагой. Препарат помещают на предметный столик микроскопа, просматривают с объективом 8х. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. По окончании исследования препарат сни­мают с предметного столика, осторожно сдвигают по­кровное стекло, чтобы край его выдавался за предмет­ное, и пинцетом сбрасывают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью.

При наблюдении под микроскопом можно заметить активное движение бактерий, которые перемещаются в разных направлениях с разной скоростью.

Не следует смешивать самостоятельное движение бактерий с броуновским движением взвешенных в воде мельчайших частиц. Броуновское движение характери­зуется беспорядочным колебанием бактерий на одном месте с отклонением то в одну, то в другую сторону. Движение бактерий не следует также смешивать с чисто механическим перемещением, когда с током жидкости все частицы передвигаются в одном направлении с оди­наковой скоростью.

Морфологические особенности бактерий различных таксономических групп.

Актиномицеты. Для изучения актиномицетов сле­дует приготовить препараты-отпечатки. Покровное стекло наложить на поверхность колонии, слегка прижать для получения четкого отпечатка, снять с помощью препаровальной иглы и поместить на предметное стекло отпе­чатком вверх. Теперь с ним следует обращаться, как с препаратом бактерий: высушить, зафиксировать в пламени, окра­сить и микроскопировать, используя объектив 90^х с им­мерсией. Отпечаток таким же образом можно получить и на предметном стекле.

Палочки спорообразующие: Bacillus subtilis (сенная палочка). Грамположительные палочки, подвижные (до спорообразования), с закругленными концами, крупные (3 – 5 х 0,6 мкм), образующие овальные эндоспоры; при росте на мясо-пептонном агаре формируют сухие бугристые колонии сероватого цвета с лопастными краями. Аэробные микроорганизмы. В жидких средах образуют морщинистую беловатую пленк на поверхности. Эти палочки широко распространены в природе, характеризуются высокой протеолитической активностью. Оптимальная температура для их роста 37 ^оС, но они способны расти и при низких температурах (несколько выше 0 ^оС).

Палочки аспорогенные: бактерии кишечной группы относятся к семейству Еnterobacteriaceae, широко распространены в природе. Они имеют форму полиморфных палочек длиной 1,5 – 3 мкм; они грамотрицательные, неспорообразующие, подвижные – перитрихи; встречаются и неподвижные виды. На плотных питательных средах образуют плоско-выпуклые колонии диаметром 2 – 3 мм, с ровным краем, серовато-мутноватого цвета, с блестящей поверхностью. Могут сохраняться длительное время в воде и почве. При 60 ^оС погибают через 15 мин.

Бактерии кишечной группы являются санитарно-показательными микроорганизмами – индикаторами фекального загрязнения продуктов, воды, оборудования, рук производственного персонала. Фекальное загрязнение даже в ничтожной степени опасно, потому что при этом могут попадать в продукты и воду патогенные микроорганизмы. Присутствие санитарно-показательных микробов в том или ином объекте (вода, пищевые продукты) указывает на возможное наличие и патогенных бактерий. Бактерии E. сoli считаются условно – патогенными.

Извитые формы: выбрионы и спириллы просматривают на фиксированном и окрашенном препарате, который легко приготовить из навозной жижи, инкубировав её предварительно2-3 суток в термостате при 30±2 °С.

Спирахеты можно обнаружить в фиксированном окрашенном препарате зубного налета. Зубные спирахеты (Spirachaeta dentus) очень тонкие, короткие (не более 3 завитков).

Окраска капсулообразующих микробов (окраска капсул). Используют бактерии рода Leuconostoc, выращенные на питательной среде (МПА) с добавлением сахарозы (6%).

Кокки: для исследования используют культуры Micrococcus coralinus, Lactococcus lactis, Sarcina flava.

Измерение микроскопических объектов. Размеры микроорганизмов определяют в живой 12—18-часовой культуре. Культура микробов такого возраста имеет бо­лее или менее однородные клетки, характерные для дан­ного вида. Единицей измерения является микрометр (1 мкм = 1  10^{– 6} м).

Микробы измеряют окулярным микрометром. Для определения цены деления окулярного микрометра поль­зуются объект-микрометром.

Окуляр-микрометр – это круглая стек­лянная пластинка с нанесенной произвольной шкалой, разделенной на десятые и двадцатые доли миллиметра (Рис. 3.41.). Обычная длина шкалы 5 мм.

Объект-микрометр — это предметное стекло со шкалой в 0,5 или 1 мм, разделенной на сотые доли, т. е. цена одного деления равна 0,01 мм, или 10 мкм (Рис. 3.42).Техника измерений заключается в следующем. От­винчивают верхнюю линзу окуляра. Окулярный микро­метр помещают делениями вниз на диафрагму окуляра и завинчивают верхнюю линзу только до получения яс­ного изображения шкалы. Поместив объект-микро­метр на предметный столик микроскопа, совмещают первые черты шкал обоих микрометров, затем отсчи­тывают, во сколько делений объективного микрометра укладывается шкала окулярного микрометра. Напри­мер, шкала окулярного микрометра в 50 делений соот­ветствует 10 делениям объект-микрометра (одно деление объект-микрометра равно 10 мкм, а 10 делений = 100 мкм). Отсюда одно деление окулярного мик­рометра равно 100:50=2 мкм.

Определив величину деления окулярного микрометра, объект-микрометр заменяют препаратом и произ­водят измерение исследуемого объекта. Если измеряемая клетка занимает в длину 2,5, а в ширину 0,75 деления окулярного микрометра, значит длина ее 2,5х2=5 мкм, а ширина 0,75х2=1,5 мкм.

Ус­тановлены значения величин окулярного микрометра для всех возможных комбинаций увеличений окуляров и объективов современных биологических микроскопов (табл. 5), что исключает необходимость при­менять объект-микрометр и ускоряет работу по определению размеров микроорганизмов.

Таблица 5

Определение цены деления окуляр-микрометра в зависимости от

увеличения окуляра и объектива

Окуляр	объектив	Общее увеличение	Цена деления линейки окулярного микрометра, мкм	Окуляр	объектив	Общее увеличение	Цена деления линейки окулярного микрометра, мкм
7	8	56Х	21,3	10	40	400Х	3,4
7	20	140Х	8,5	10	90	900Х	1,5
7	40	280Х	4,2	15	8	120Х	15,0
7	90	630Х	1,9	15	20	300Х	6,0
10	8	80Х	17,2	15	40	600Х	3,0
10	20	200Х	6,9	15	90	1350Х	1,3