Культуральные и морфологические особенности бактерий различных таксономических групп. Исследование на подвижность, измерение размеров бактериальных клеток.

Цель работы: Освоить цитохимические методы окрашивания бактерий (окраска клеток по Граму, окраска спор, капсул, жгутиков, различных включений бактериальных клеток), позволяющие дифференцировать культуры на основе внутреннего строения клеток; научиться диагностировать некоторые виды бактерий по совокупности их культуральных и морфологических свойств.

Задания:

1. Приготовить фиксированные препараты бактерий родов Micrococcus, Bacillus и Escherichia . Изучить их морфологию.

2. Промикроскопировать готовые препара­ты с различными формами клеток бактерий: спирохет, микрококков, диплококков, стрептококков, вибрионов, спирилл. Зарисовать.

3. Изучить морфологию актиномицетов, приготовив мазки-отпечатки отдельных видов этих микроорганизмов.

4. Произвести окраску жгутиков, спор, капсул, клеточных включений.

5. Изучить подвижность бактерий в препаратах «висячая» и «раздавленная» капли.

6. Выявить способность к образованию эндоспор у Bacillus subtilis.

7. Освоить методы измерения бактериальных клеток.

8. Окрасить по Граму культуры бактерий родов Bacillus и Escherichia (см. лабораторную работу №2).

9.Описать культуральные признаки изучаемых видов бактерий.

Оборудование и материалы: водный раствор фуксина, фкуси Циля, протрава, раствор метиленового синего, фуксин Пфейффера, раствор с массовой долей нейтрального красного 0,5%, раствор с массовой долей хромовой кислоты 5%, раствор с массовой долей серной кислоты 5%, раствор с объемной долей этилового спирта 96%, формалин, предмет­ные стекла, мыло, бензин, иммерсионное масло, стерильная водопро­водная вода, бактериологические петли, микроскоп, марлевые сал­фетки, окуляр и объектив микрометры. Готовые препараты культур Spirochaeta dentium, Vibrio El-tor, Rhodospirillum rubrum, Streptococcus lactis, Azotobacter chroococcum, Micrococcus citreus. Суточные культуры микроорганизмов Escherichia coli, Sarcina flava, Bacillus subtilis, 7-суточная культура Actinomyces. Предметные и покровные стекла, предметные стекла с лунками, вазелин, фильтровальная бумага, сте­рильная вода, бактериологические петли, иммерсионное масло, микроскопы, культуры Bacillus subtilis, Escherichia coli, Lactobacillus bulgaricum, Leuconostoc dextranicum.

Теоретические сведения

В клетках различных живых существ ядерное вещество (генофор) может быть организовано в настоящее сложное ядро, имеющее собственную ядерную оболочку (растения, животные, грибы, простейшие) или не быть отделено от цитоплазмы какой-либо мембраной (бактерии). По этому признаку выделяют два уровня клеточной организации: эукариотную и прокариотную. К прокариотам относятся бактерии.

Наиболее существенные отличия прокариот следующие:

а) генофор (ядро, нуклеотид, нуклеоплазма) представлен молекулой ДНК, свободно «плавающей» в цитоплазме. Он не имеет собственной ядерной мембраны, поэтому генофор иногда называют диффузионным ядром.

б) отсутствие внутриплазматических органелл, окруженных элементарной мембраной;

в) рибосомы малого размера расположены не на поверхности мембран, а рассеяны в цитоплазме,

г) большинство бактерий синтезирует пептидогликан (муреин, мукопептид), который входит в состав клеточных стенок;

д) среди бактерий распространен анаэробиоз (жизнь без кислорода), что у эукариот встречается крайне редко;

Согласно современной классификации все бактерии объединены в царство прокариот, состоящее из отделов: автотрофные фотобактерии и гетеротрофные хемобактерии. В свою очередь отделы включают по три класса каждый.

Первый отдел объединяет цианобактерии, пурпурные и зеленые фотобактерии, источником клеточного углерода для которых служит углекислый газ воздуха, ассимилируемый ими под действием солнечного света в процессе фотосинтеза. Представители этих классов широко распространены в природе. Это сапрофитные фототрофные микроорганизмы, обитающие в сточных водах, почве, морской и пресной водах.

Второй отдел включает класс эубактерий ( собственно бактерий), риккетсий ( внутриклеточных паразитов) и микоплазм (бактерии, не имеющих клеточных стенок). Хемоорганогетеротрофы, составляющие этот отдел , используют в процессе роста и развития органическое вещество и не нуждаются в солнечной энергии . Именно эубактерии представляют интерес для специалистов пищевой и перерабатывающей промышленности.

Имеет место классификация бактерий, основанная на морфологических признаках, а именно, строении и составе клеточной стенки. Царство Прокариот подразделяется на четыре отдела: фирмикутные - грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку, в состав которой входят муреин, тейхоевые и тейхуроновые кислоты;

грациликутные – грамотрицательные бактерии, не синтезирующие муреин, тейхоевые и тейхуроновые кислоты:

тенерикутные – не имеющие клеточной стенки (микоплазмы);

мендозикутные – клеточная стенка присутствует, но не содержит пептидогликана и мураминовой кислоты.

С целью дифференциации ( не классификации ), согласно «Определителю бактерий Берги»( 9 издание), по фенотипическим признакам прокариоты разделены на четыре категории:

1. Грамотрицательные эубактерии, имеющие клеточные стенки, содержащие пептидогликан;

2. Грамположительные эубактерии, имеющие клеточные стенки, содержащие пептидогликан;

3. Микоплазмы – не имеющие клеточных стенок, клетки которых окруженаы цитоплазмотической мембраной

4. Архебактерии - имеющие клеточные стенки, не содержащие муреина ( их клетки покрыты макромолекулами протеина и гетерополисахаридами).

По сравнению с морфологическим разнообразием клеток многоклеточных организмов бактерии морфологически относительно мало дифференцированы рис.( ).

Наиболее простой формой бактериальной клетки является сферическая. Такую форму имеют кокки (от греч. kokkos - зерно, шарик), которые у разных бактерий различаются своими размерами и взаимным расположением после деления клеток. Диаметр клеток у кокковидных форм варьирует от 1,5 до 2,5 мкм. Они не образуют спор, неподвижны, разнообразны по физиоло­гическим свойствам и широко распространены в природе.

Они делятся на следующие группы:

• микрококки – встречаются в виде одиночных шаровидных клеток. Примером можно назвать Micrococcus coralinus.

• диплококки – клетки делятся в одной плоскости и располагаются парами (от греч. diploos - двойной). Иногда соединенные попрано кокки бывают почковидно изогнуты, напоминая кофейные зерна. Пример диплококков – Azetobacter crococcum (азотфиксирующие бактерии).

• стрептококки – деление кокков происходит в одной плоскости, но особи не отделяются друг от друга, а образуют длинные цепочки, напоминающие нити бус (от греч. streptos - цепь). Такую форму образуют пиогенные стрептококки Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis (индикатор фекального загрязнения). Стрептококковую форму имеют многие молочнокислые бактерии рода Lactococcus, например L.lactis, L.cremoris.

• сарцины (о лат. sarceo – соединяю) – клетки делятся относительно равномерно и правильно в трех взаимноперпендикулярных плоскостях, образуя скопления кубической формы, в виде пакетов, состоящих из 8,16 и т.д. кокков. Примером таких форм являются пигментные формы, наиболее часто встречающиеся в воде, воздухе, почве, на пищевых продуктах

• стафилококки – делятся неравномерно в нескольких плоскостях. Оставаясь вместе, они образуют скопления, напоминающие виноградную гроздь ( от греч. staphylos – виноградная гроздь). Среди стафилококков встречаются сапрофиты, присутствующие в воде, почве, на поверхности растений, молочных и мясных продуктов, и патогенные, возбудители фурункулезов, маститов и других гнойных заболеваний. На коже и слизистых теплокровных животных, в различных пищевых продуктах, в воздухе встречаются условно-патогенные стафилококки

• тетракоккки – делятся в двух взаимноперпендикулярных плоскостях. Образуя группы по четыре клетки (тетрады). Это редко встречающиеся формы, зачастую окруженные толстыми капсулами.

Цилиндрические бактерии. Наиболее многочисленны палочковидные формы бактерий. К ним относятся формы, образующие споры, и не образующие их.

Неспороносные палочки. Типичны­ми представителями цилиндрических форм являются псевдомонады. Эти бактерии используют широкий спектр питательных веществ и благодаря этому широко распространены в природе. Среди них встречаются как пато­генные для человека, животных, растений и насекомых, так и сапрофитные формы. Например, Pseudomonas aeruginosa — мелкие палочки, одиночные или соединенные в пары, сапрофиты, но часто являются возбудителями вторичной инфекции долго незаживающих ран и язв у человека и животных. Pseudomonas fluorescens — мел­кие палочки, часто встречающиеся в воде, почве, на раз­ных субстратах. Среди них встречаются высокопатоген­ные для личинок кровососущих комаров. С помощью псевдомонас синтезируются некоторые органические кис­лоты.

Одной из наиболее изученных неспороносных палочек является Bacterium coli или по имени описавшего ее ис­следователя Escherichia coli. Эта палочка всегда содер­жится в кишках людей и позвоночных животных. По­этому обнаружение ее в воде и пищевых продуктах сви­детельствует об их вероятном загрязнении кишечной ми­крофлорой. Некоторые штаммы кишечной палочки вызы­вают у людей заболевание. Палочки Serratia marcescens (от Serratia — имя итальянского мореплавателя, marces­cens — гниющий) обладают способностью образовывать кроваво-красный пигмент при развитии на пищевых про­дуктах.

В геохимических преобразованиях большая роль при­надлежит тионовым палочкам (Thiobacillus). Это ма­ленькие неспоровые палочки. Наиболее изучены из них Thiobacillus thiooxidans, окисляющие серу, и Thiobacil­lus ferrooxidans, окисляющие также и железо.

Палочки Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, вы­зывающие брюшнотифозные заболевания, названы саль-монеллами в честь Сальмона, выделившего их в 1885 г. в Америке. Палочки дизентерии Shigella названы шигеллами в честь микробиолога Шига, доказавшего их роль в заболевании дизентерией в 1898 г.

С п о р о о б р а з у ю щ и е п а л о ч к и широко рас­пространены в природе. Их обнаруживают в самых раз­личных почвах любых континентов, на скальных породах горных массивов, в морях, пресных водах озер и рек, во­дах глубинных нефтяных источников, в кишках человека и животных.

Облигатные анаэробные бациллы — клостридии (рис. 3.1.(13)) Clostridium butyricum вызывают маслянокислое брожение с образованием в качестве главных продуктов масляной и уксусной кислот. Другие клостридии могут быть возбудителями раневых инфекций — гангрены (Clostridium perfringens), столбняка (Clostridium tetani); Clostridium botulinum (от лат. botulus—колбаса) продуцирует токсины, вызывающие опасные пищевые от­равления.

Довольно обширную группу бактерий составляют аэробные спорообразующие бациллы (рис. 3.1 (11)). Среди этих бацилл имеются патогенные для человека, животных и растений формы. Bacillus anthracis — возбудитель сибирской язвы у человека и животных, Bacillus thuringiensis — энтомо-патогенная бацилла.

К сапрофитным формам относятся Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Ba­cillus polymyxa.