Методы микроскопирования биологических объектов

Цель занятия. Ознакомиться с устройством и принципом работы светового микроскопа. Освоить методики приготовления препаратов живых клеток биологических объектов и технику микроскопирования.

Задания:

1. Изучить устройство и правила пользования микроскопом.

2. Приготовить препараты микробных культур: грибов, дрожжей, бактерий. Просмотреть, зарисовать.

Оборудование и материалы: микроскопы, обезжиренные предметные стекла, покровные стекла, кристаллизатор с подставкой для предметных стекол, газовые горелки, бактериологические петли, дезинфицирующий раствор, марлевые салфетки, водопроводная вода в пробирках, фильтровальная бумага, суточные культуры Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae и Rhizopus species, выращенные на МПА и СА

Теоретические сведения

1.1.Устройство современного светового микроскопа

Возможности человеческого глаза ограничены приро­дой. Чувствительные рецепторы зрительного нерва в сет­чатке имеют сравнительно большой диаметр (несколько микронов), и если лучи света от двух точек, расположен­ных очень близко друг от друга, попадают на один и тот же рецептор, то изображение этих объектов сливается и глаз не различает их как две точки, т. е. глаз их не раз­решает. Здоровый человеческий глаз на расстоянии 25 см от объекта формирует изображение двух точек раздельно, если они находятся друг от друга не ближе, чем 0,1 мм. Наименьшее расстоя­ние между двумя точками, изображение которых глаз формирует раздельно, называется разрешающим рассто­янием. Чем меньше разрешающее расстояние для данно­го оптического прибора, тем больше его разрешающая способность (d). Чтобы повысить разрешаю­щую способность человеческого глаза, люди издавна на­чали применять увеличительные стекла (линзы). Факти­чески это были первые простые микроскопы (от греч.mikros. – малый, skopeo - смотрю),

При помощи микроскопов изучают морфологию клеток микроорганизмов, проводят первичную идентификацию ( от лат identificare- отождествление) исследуемых организмов, наблюдают рост, развитие, характер формирования микробных ассоциаций, ценозов ( сообществ) в различных субстратах.

Все современные микроскопы принципиально устрое­ны одинаково и фактически представляют собой лишь «улучшенные» модели старых. При изучении микробиологических объектов применяют микроскопы разных моделей Наиболее распространены МБИ-1, МБИ-2, МБИ-6, МБИ-10 и учебные микроскопы биологические рабочие ( МБР-1, МБР-1А). Они состоят из механической части и оптической системы..

Механическая часть микроскопа МБР-3 ( рис.1) состоит из основания штатива 1, коробки с микромеханизмом 2, тубусодержателя 4, бинокулярной насадки 5, револьвера объектива 6, предметного столика 3. Для перемещения тубуса с обеих сторон микроскоп снабжен макровинтом 14 и микровинтом для тонкой фокусировки 11. На правой рукоятке тонкой фокусировки закреплен барабан со шкалой, разделенной на 50 частей. Цена одного деления шкалы барабана 0,002 мм. Один оборот барабана соответствует перемещению тубуса на 0,1 мм. Общая величина перемещения тубуса от упора до упора равна 2,2-2,4 мм. Перемещение тубуса рукояткой макровинта возможно в пределах 50 мм.

Предметный столик имеет центровку при помощи винтов 19 и взаимно перпендикулярное перемещение препарата. Перемещение в продольном направлении осуществляется вращением рукоятки 12, в поперечном – рукоятки 18.Отсчет перемещения в обоих направления может производиться по шкалам и нониусу с точностью до 0,1 мм. Верхняя часть тубусодержателя заканчивается головкой 15, служащей для крепления револьвера и тубуса .

.

Оптическая система микроскопа включает окуляры 10, объективы 9 и осветительное устройство, предназначенное для освещения рассматриваемого объекта Все части оптической системы строго центрированы относительно друг друга.. Главной частью микроскопа являются объективы ( от лат.objectum – предмет), представляющие собой систему линз Из них лишь одна, так называемая фронтальная ( наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату), производит увеличение. Все остальные корригируют изображение и поэтому называются коррекционными.

Объективы бывают двух систем: ахроматы и апохроматы. Ахроматы устроены проще, но име­ют ряд недостатков, ко­торые устранены в более сложных апохроматических объективах. При применении объективов апохроматов достигается полная ясность изобра­жения и устраняется хроматическая аберра­ция. Последнее особен­но важно при микроско­пии цветных объектов. Все объективы (ахрома­ты и апохроматы) разделяются на сухие и иммерсионные. Если между объективом и рассматриваемым препаратом находится воздух, то подобный объектив — сухой. Если же объектив погружен в жид­кость, заполняющую пространство между его фронтальной линзой и препаратом, то подобный объектив называется погруженным, или иммерсионным.

Иммерсионные объективы имеют преимущество перед сухими. При микроскопии с помощью сухой системы световые лучи, идущие от зеркала через конденсор 8 в объектив, проходят через неоднород­ные среды, различающиеся показателями преломления. Так, из воз­духа (показатель преломления 1,0) пучок световых лучей попадает в стекло (показатель преломления 1,52), затем опять в воздух и, наконец, во фронтальную линзу объектива. При каждом из этих переходов часть лучей, преломляясь на границе разнородных сред, отклоняется в сторону и не попадает в объектив (рис. 2). В результате поле зрения освещается недостаточно, что особенно важно при пользова­нии сильными системами, где очень малы фронтальные линзы. Чтобы избежать этого, объектив погружают в каплю жидкости (им­мерсионное масло, вода), показатель преломления которой близок к показателю преломления стекла. Вторую каплю той же жидкости наносят на конденсор. Таким образом, конденсор, жидкость, препа­рат, жидкость и объектив представляют собой единую систему, не вызывающую отклонения светового луча.

Иммерсионные объективы на оправе имеют черную круговую нарезку и обозначение: I- immersion (иммерсия); HI –homogen immersron - (однородная иммерсия), OI-oil immersion, МИ-масляная иммерсия или ВИ- водная иммерсия.

Характеристика объектива состоит из его собственного увеличения, фокусного расстояния и численной апертуры. Собственное увеличение объектива ( V ) определяют по формуле: V = I/f , где I - оптическая длина тубуса или расстояние между фокальной плоскостью объектива и плоскостью изображения, составляющее для разных объективов 128-180 мм, f - фокусное расстояние объектива. Чем меньше фокусное расстояние, тем сильнее объектив, больше его собственное увеличение. Так, объективы с увеличением х8, х40, х90 имеют соответственно рабочие расстояния 13,8; 0,6 и 0,12 мм. В зависимости от того, с каким объективом работаешь, для его фокусировки выбирается макрометрический или микрометрический винт. На корпусе объектива выгравированы обозначения собственного увеличения ( х8, х20, х40, х90) и численная апертура. Численная апертура – произведение показателя преломления среды на синус половины отверстного угла ( рис 3 ), для объектива это характеризующий угол, под которым еще может входить в объектив наклонный луч.

Окуляры ( от лат.okularus –глазной) состоят из двух плоско-выпуклых линз (собирающей и глазной). Окуляр служит непосредственным продолжением «линз» (хрусталиков ) глаз человека. Окуляры увеличивают изображение, получаемое с помощью объектива, в 5-10-15 раз. Такие простые окуляры, чаще всего Гюйгенса или Рамсдена, обычно применяют с ахроматическими объективами. При работе с апохроматами нужно применять специальные, так называемые компенсационные, окуляры. В этих окулярах линзы подобраны таким образом, что они дают хроматическую ошибку, обратную остаточному хроматизму апохромата и потому ее компенсирующую. Назначение окуляра – прямое мнимое увеличение действительного обратного и увеличенного изображения, которое дает объектив. На оправе окуляра гравируется цифра, показывающая, во сколько раз данный окуляр повышает собственное увеличение объектива.

В окуляре может быть вмонтирована специальная указка, с помощью которой можно обратить внимание исследователя на какой-нибудь из находящихся в поле зрения объект или часть объекта. Для этого перемещают предметный столик таким образом, чтобы исследуемый объект был на кончике указки.

Осветительное устройство (или осветительный аппарат Аббе) составляют зеркало, ирис-диафрагма и конденсор (рис. 3). Оправа зеркала вмонтирована в специальной вилке, благодаря чему оно может вращаться в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Одна из отражающих поверхностей зеркала плоская, другая вогнутая.

Ирис-диафрагма, сокращаясь по типу зрачка, позво­ляет регулировать величину светового пучка, поступающего в кон­денсор. Это важно потому, что светосила (апертура) конденсора всегда должна быть немного меньше, чем у объектива.

Конденсор представляет собой систему линз, вмонтированных в коническую металлическую оправу. Чем больше линз, тем больше светосила конденсора. Для получения отчетливого изображения не­обходимо, чтобы препарат оказался в фокусе конденсора. С этой целью конденсор передвигается в вертикальном направлении в пре­делах 20 мм.