2. Периоды репликации

Для репликации (как и для всякого матричного процесса) характерны три периода:

1. Инициация.

2. Элонгация.

3. Терминация.

Инициация

Репликация начинается в нескольких точках молекулы ДНК. Это связано с тем, что размер генома типичной клетки млекопитающих составляет около 10⁹ пар нуклеотидов (п.н.). В ДНК средней по величине хромосомы человека содержится несколько десятков миллионов п.н. При скорости репликации примерно 1000 пар нуклеотидов в минуту для полного завершения репликации молекулы ДНК в хромосоме понадобится несколько суток. Для клетки такой срок репликации генома совершенно не приемлем, т.к. во время репликации ДНК не осуществляется важный процесс – транскрипция РНК. Во время репликации ДНК практически все гены клетки, контролирующие её метаболизм, жизнедеятельность, адаптацию и специфические клеточные реакции выключены. Это связано с тем, что два процесса – синтез ДНК (репликация) и РНК (транскрипция) с их громоздким ферментативным обеспечением – одновременно на одной и той же матрице (материнской ДНК) происходить не могут. Поэтому в момент репликации происходит почти полное выключение транскрипции. Это ставит клетку в неблагоприятные условия, т.к. отсутствие экспрессии генов приводит к недостатку белков-ферментов, и, следовательно, к нарушению нормального течения метаболизма. Однако следует отметить, что природа предусмотрела специальные механизмы, которые снижают для клетки опасность выключения транскрипции. Например, в период предсинтеза ДНК (т.е. перед началом репликации) в цитоплазме клетки заранее накапливается достаточное количество всех видов РНК для поддержания синтеза белка в период репликации ДНК на необходимом для жизнедеятельности клетки уровне. Поэтому во время синтеза ДНК трансляция осуществляется (хотя и не в полном объёме), транскрипция же практически не идёт. В любом случае ещё раз подчеркнём, что время, на протяжении которого идёт процесс репликации ДНК, для клетки очень опасно. Поэтому не случайно в эво-

6

люции были созданы механизмы, до предела сокращающие время репликации ДНК в хромосомах. Таких механизмов несколько, но один из них достаточно прост: репликация начинается одновременно в нескольких точках молекулы ДНК и идёт от этих точек в разных направлениях. Приблизительные расчёты показали, что в молекуле ДНК одной хромосомы таких точек насчитывается несколько тысяч.

Такое большое количество мест, в которых начинается репликация ДНК хромосомы, несомненно существенно сокращает время её синтеза. Точки, в которых начинается репликация, носят название точки начала репликации (т.н.р.) или ориджин, ori-сайт (от англ. origin – начало). Эти точки представляют собой небольшие участки ДНК с определённой специфической последовательностью нуклеотидов. Начальным моментом репликации является присоединение к ори-сайтам специальных белков – инициаторных белков.

Рассмотрим два положения, касающихся ori-сайтов. Во-первых, репликация начинается не со всех точек одновременно. В одних точках она может пройти значительный участок, а в других только начаться. Во-вторых, от ori-сайтов процесс синтеза ДНК может двигаться в одном направлении или сразу в обоих противоположных направлениях – двунаправленная репликация ( рис. 2). У эукариот чаще всего наблюдается второй тип репликации.

Наличие ori-сайтов привело к созданию понятия репликон. Репликон - это фрагмент матричной (материнской) ДНК, на котором идёт автономный синтез дочерней ДНК. Он начинается с точки начала репликации и заканчивается точкой, где фермент заканчивает репликацию.

Е

А Г Д ДНК

Б В

Рис. 2. Схема расположения точек начала репликации. Стрелками обозначено направление синтеза ДНК от т.н.р.

У репликона три основных свойства:

а) он автономен;

б) обеспечивает процесс синтеза ДНК;

в) имеет собственное ферментативное обеспечение.

Если репликация однонаправленна, то протяжённость репликона соответствует промежутку между ori-сайтами, например репликон Б – В. Если же репликация двунаправленна (например между ori-сайтами Г – Д), то между этими точками будут располагаться два репликона Г – Е и Д – Е, где точка Е – конец двух различных процессов репликации, имеющих собственное ферментативное обеспечение. Как показали эксперименты, определить среднюю протяжённость одного репликона достаточно трудно. В связи с этим чаще всего за репликон принимают последовательность ДНК, ограниченную двумя ori-сайтами.

В точке начала репликации происходят события, которые связаны с присо-

7

единением к инициаторному белку других ферментов, запускающих целый ряд подготовительных процессов. В соответствии с очерёдностью эти события располагаются в следующем порядке:

а. Образование репликационной вилки.

б. Образование РНК-затравки.

а. Образование репликационной вилки

Образование репликационной вилки происходит в точках начала репликации. Вилка репликации представляет собой отошедшие друг от друга свободные нити матричной ДНК, на которых происходит синтез дочерних нитей ДНК. Схема образования вилок репликации представлена на рисунке 3. Две вилки репликации образуют глазок репликации. В обеих вилках репликации происходит синтез ДНК в противоположных направлениях. В глазке репликации вилки двигаются, расплетая ДНК, в противоположных направлениях.

Образованию вилок репликации предшествует целый ряд подготовительных процессов, которые, как правило, располагаются в следующем порядке:

• Освобождение молекулы ДНК от связи с гистонами в нуклеосоме.

• Деспирализация ДНК.

• Разрыв водородных связей между нитями матричной ДНК.

• Расхождение нитей ДНК.

• Фиксация матричных нитей ДНК.

Освобождение молекулы ДНК от связи с гистонами необходимый элемент периода инициации. В ядре клеток ДНК практически никогда не находится в свободном состоянии. Она связана с гистоновыми белками тетрамера и гистоном Н1. Кроме того, с ДНК взаимодействуют различные негистоновые белки, двухвалентные металлы, липиды и др. соединения. Всё это приводит к сильной спирализации отдельных участков ДНК в предсинтетическом периоде.

Каким образом происходит освобождение ДНК от связей с окружающими молекулами до конца не ясно. Однако известно, что в основе этого процесса лежат несколько химических реакций, осуществляемых ферментами – метилирование, ацетилирование и фосфорилирование положительно заряженных групп гистоновых и негистоновых белков. В результате белки теряют положительный заряд, их связи с отрицательно заряженной молекулой ДНК становятся слабыми. Это способствует высвобождению ДНК.

Сразу же после освобождения от связей с белком (или параллельно с этим) происходит процесс деспирализации ДНК. Этот процесс необходим для последующего освобождения нитей ДНК от связи друг с другом. Важное значение имеет и другой процесс. Нити молекулы ДНК не просто лежат параллельно друг другу, они взаимно закручены (см. рис. 4).

Существует множество способов раскрутки спиралей. Наиболее часто употребляемые способы показаны на рисунке 5. Очевидно, что способ А не совсем удобен, т.к. при фиксации одного конца и разведении противоположных концов создаются дополнительные силы, приводящие к формированию вторичных суперспиралей. При втором способе (противоположный конец свободен)

8

раскручивание приведёт к вращению свободного конца, а это может превратить ядро в субмолекулярный миксер, что небезопасно для клетки.

Ori-сайт

ДНК ●

ДНК

ДНК

Репликативный глазок (состоит из двух репликационных вилок)

ДНК

Левая вилка Правая вилка

Две репликационные вилки

Рис. 3. Схема образования репликационных вилок в точке начала репликации. Пунктирными стрелками показано направление движения вилок

Рис. 4. Схема взаимного расположения нитей ДНК. Водородные связи между нитями не показаны

Для их раскручивания используются ферменты, которые осуществляют разрезание, вращение и воссоединение нитей.

Принцип раскручивания спирали ДНК до конца не ясен. Один из возможных вариантов показан на рисунке 6. Суть его в том, что специальный фермент производит временный одноцепочечный разрыв в одной нити ДНК. И через этот разрез проходит (протаскивается) противоположная нить ДНК. При этом один виток спирали распрямляется. Затем разрез ликвидируется. Процесс

разрезания, расплетения и сшивки может повторяться множество раз по мере продвижения репликационной вилки по молекуле ДНК.

9

Все реакции, связанные с раскручиванием нитей ДНК осуществляют ферменты топоизомеразы. Уместно отметить, что аналогичным образом действуют эти ферменты и при другом процессе – транскрипции. Следует отметить, что одновременно специальные ферменты хеликазы разрывают водородные связи между оппозитными (противоположными) нитями ДНК делая их свободными.

А

Б

Рис. 5. Способы раскручивания верёвки. А – противоположный конец фиксирован, Б – противоположный конец свободен

Освобождённые из дуплекса нити ДНК долго оставаться в свободном состоянии не могут. Они или вновь соединяются, или взаимодействуют с активными реагентами из окружающего пространства, или формируют шпильки. Любой вариант способен нарушить нормальный ход репликации. Для предотвращения этого существуют специальные белки – SSB-белки. Эти белки обладают сродством к одноцепочечной ДНК и с появлением последней сразу же соединяются с ней на всём её протяжении, составляя жёсткий каркас, препятствуя не только её реакциям, но и образованию шпилек (рис. 7, 1).

Важным свойством этих белков является то, что они оставляют открытыми для реакций нуклеиновые основания одноцепочечной нити ДНК, что чрезвычайно важно для последующего синтеза дочерних нитей ДНК.

б. Образование РНК-затравки

После завершения всех вышеперечисленных процессов репликативная вилка почти готова к синтезу ДНК и выглядит как показано на рисунке 7, 1. Однако для полной готовности ДНК к репликации не хватает одной существенной детали. Синтез дочерних нитей в соответствии с матричными свободными нитями ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза. Однако начать процесс синтеза новой нити этот фермент не может. Он способен только продолжить синтез уже начатой цепочки. Поэтому другой фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНК-праймаза) вначале синтезирует на обеих разошедшихся в репликационной вилке матричных нитях ДНК небольшой участок РНК. Эта РНК носит название РНК-затравка (РНК-праймер или просто праймер) (на рис. 7 они обозначены буквами «А» и «Б»). РНК-затравки синтезируются параллельно матричным нитям ДНК по принципу комплементарности. Причём на одной нити РНК-затравка

10

(на рис. 7 она обозначена как «А») синтезируется, начиная с ori-сайта в сторону вилки репликации, на оппозитной нити РНК-затравка (на рис. 7 она обозначена как «Б») синтезируется, отступя от ori-сайта в его сторону.

Разрез в нити № 2 и протягивание через разрез нити № 1

1

А

Б 2

2

В

1

Г

Д

Рис. 6. Схема деспирализации отрезка молекулы ДНК путём разрезания одной нити, протаскивания другой, раскручивания и сшивки разреза после деспирализации участка. Водородные связи между нитями не показаны

Синтезом двух РНК-затравок на двух противоположных нитях матричной ДНК заканчивается период инициации.

Элонгация

Фермент ДНК-полимераза начинает синтез новых нитей ДНК с 3’-концов двух РНК-затравок (А и Б на рис. 7, п. 2). При таком синтезе дочерние молекулы ДНК на матричных нитях будут синтезироваться в противоположных направлениях.

Элонгация начинается с присоединения одного нуклеотида к 3’-концу РНК-затравки. Это присоединение осуществляет фермент ДНК-полимераза. К первому нуклеотиду ДНК-полимераза присоединяет второй, третий и т.д. нуклеотид в соответствии с принципом комплементарности к нуклеотидам, находящимся на матричной нити ДНК. Основания нуклеотидов новой нити и матричной соединяются друг с другом водородными связями. Поскольку синтез новой нити ДНК начинается с 3’-конца РНК-затравки, к которому присоединяется 5’-конец первого нуклеотида ДНК, то принято говорить, что синтез дочерней нити ДНК происходит в направлении 5^’– 3’. На той матричной нити, где синтез

11

дочерней нити идёт в сторону вилки репликации, он идёт непрерывно, и по мере раскручивания нити фрагмент синтезированной ДНК будет постоянно удлиняться. Чем дальше продвигается вилка репликации, тем длиннее будет вновь синтезированная цепь ДНК. Эту нить ДНК называют непрерывной, лидирующей или ведущей. В дальнейшем никаких РНК-затравок на матричной нити ДНК, с которой реплицируется лидирующая нить, не формируется. Сложнее происходит синтез дочерней ДНК на противоположной нити материнской ДНК, которая имеет направление 5^’- 3’. К синтезированной на этой нити РНК-затравке (на рис.7 обозначена как «Б») нуклеотиды будут присоединяться также к 3’-концу и новая цепь будет синтезироваться в сторону от вилки репликации (рис.7, 2). Эту нить дочерней ДНК называют отстающей, запаздывающей. Таким образом, в репликативной вилке одновременно синтезируются две дочерние нити ДНК – ведущая (она синтезируется в направлении движения вилки репликации) и отстающая (синтезируется в направлении противоположном движению вилки репликации), т.е. направление синтеза обеих дочерних цепей противоположно.

Синтез запаздывающей нити ДНК происходит не постоянно, а фрагментами. После окончания синтеза одного фрагмента вблизи репликационной вилки вновь происходит синтез РНК-затравки «С». С 3’-конца этой затравки вновь начинается синтез дочерней нити ДНК в направлении РНК-затравки «Б» и по её достижению синтез вновь прекращается – сформировался второй фрагмент ДНК, который начинается от РНК-затравки «С». Фактически на отстающей цепи мы имеем два фрагмента, которые состоят из соединённых друг с другом РНК и ДНК. Один фрагмент ДНК начинается с РНК-затравки «Б», второй – с РНК-затравки «С». Эти фрагменты ДНК носят название фрагменты Оказаки (рис. 7,3).

Последующие раунды репликации повторяются – топоизомераза раскручивает очередной виток спирали ДНК, хеликаза разрывает водородные связи между нитями ДНК и они расходятся, белки SSB фиксируют нити, лидирующая цепь продолжает удлиняться, на отстающей цепи синтезируется третий фрагмент РНК-затравки – «Д» и с его 3’-конца начинает синтезироваться новый фрагмент Оказаки. Затем на отстающей нити ДНК РНК-затравки разрушаются и оставшиеся фрагменты ДНК соединяются в единую цепь (рис. 8). Таким образом, на отстающей нити идут непрерывно 4 процесса: образование новых РНК-затравок, синтез с их 3’-конца фрагментов Оказаки, разрушение РНК-затравок и воссоединение фрагментов в единую цепь.

Терминация

Синтез ДНК продолжается до тех пор, пока не встретятся две репликативные вилки или когда репликативная вилка не подойдёт к концу молекулы ДНК в хромосоме. После встречи репликативных вилок синтезированные дочерние цепи ДНК из соседних вилок соединяются ферментом. Сложнее происходит терминация в случае, если репликативная вилка подошла к концу молекулы ДНК. Но и здесь репликацию прекращают специальные ферменты (рис. 9).

12