БИОИНЖЕНЕРИЯ
.pdf
МУЛЬТИЦИСТРОННЫЕ ВЕКТОРЫ
IRES элементы (Internal Ribosome Entry Site )
Были открыты в РНК полиовирусов, необходимые им для трансляции вирусного генома в клетках эукариот
Плазмиды для клонирования с IRES элементом
2А пептиды
Открыты в пикорнавирусах, позволяющие им транслировать множество белков в одинаковом количестве с одной мРНК
ПЕПТИД |
АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ |
|
|
T2A |
(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P |
|
|
P2A |
(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P |
|
|
E2A |
(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P |
|
|
F2A |
(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P |
|
|
Плазмиды для клонирования с 2А элементом
Вирусные экспрессионные векторы
Преимущества:
•Доставка ДНК с специфические клетки
•Повышение эффективности трансфекции
•Контроль количества вирусных частиц
•Простота клонирования и модификации
Основные вирусы, используемые в лабораториях:
•Адено-ассоциированные вирусы (AAV)
•Аденовирусы
•Гамма-ретровирусы
•Лентивирусы
Векторы на основе аденоассоциированных вирусов
|
Преимущества: |
|
|
|
онДНК-геном |
||
не иммуногенны |
|||
|
встраиваются в специфический сайт в хромосоме 19
не патогенны
способны инфицировать неделящиеся клетки
длительная экспрессия трансгена
Недостатки:
небольшой размер клонируемой ДНК (до 4.5 т.п.н.)
Основные элементы AAV
Элемент |
Тип плазмиды |
Условия работы |
Назначение |
|
|
|
|
ITR |
Для клонирования |
in cis |
Инвертированные терминальные |
|
|
|
повторы размером по 145 оснований. |
|
|
|
Симметричное расположение |
|
|
|
необходимо для размножения |
|
|
|
вирусного генома. |
|
|
|
Последовательности ITR формируют |
|
|
|
Т-образую шпильку, необходимую |
|
|
|
для репликации вирусного генома. |
|
|
|
|
Rep |
Для упаковки |
in trans |
Четыре варианта пакующих белков: |
|
|
|
Rep78, Rep68, Rep52, Rep40. |
|
|
|
Необходимы для репликации генома |
|
|
|
и интеграции вирусного генома в ДНК |
|
|
|
клетки. |
|
|
|
|
Cap |
Для упаковки |
in trans |
Три варианта структурных белков: |
|
|
|
VP1, VP2, VP3. VP1 обладает |
|
|
|
фосфолипазной активностью и |
|
|
|
необходим для освобождения |
|
|
|
вирусных частиц из поздних эндосом. |
|
|
|
VP2 и VP3 требуются для правильной |
|
|
|
сборки вирионов, а так же |
|
|
|
определяют серотип вируса и его |
|
|
|
тропизм. |
|
|
|
|
