4.3. Термолабильность.

Как и многие белки, при повышении температуры ферменты подвергаются термической денатурации, что приводит к нарушению нативной конформации фермента и изменению структуры активного центра. Ферменты млекопитающих начинают заметно денатурировать при температурах выше 40^оС.

В связи с вышесказанным, ферментные препараты желательно хранить при пониженных температурах. Одним из лучших путей сохранения ферментов является их лиофилизация (высушивание при температуре ниже -70^оС в вакууме), переведение в частично денатурированное состояние с помощью солей аммония и помещение в холодильник.

4.4. Зависимость скорости реакции от температуры. Скорость ферментативных реакций, как и любых химических реакций, зависит от температуры. При повышении температуры на 10^оС скорость реакции увеличивается в 2-4 раза согласно правилу Вант-Гоффа. Однако при температурах выше 40^оС существенной становится денатурация ферментов, что приводит к уменьшению суммарной активности (рис. 2):

Рис. 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

4.5. Зависимость скорости реакции от рН. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН имеет колоколообразный вид (рис. 3). Значения рН, при которых наблюдается наиболее высокая скорость ферментативной реакции, называют оптимальными (рН-оптимум). Характер кривых и значение рН-оптимума зависит от природы заряженных групп субстрата и заряженных групп фермента (особенно тех, которые входят в активный центр). Оптимум рН для большинства ферментов лежит в пределах от 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН.

Однако, есть и исключения, например, пепсин наиболее активен при рН 1,5 – 2,0, а щелочная фосфатаза при рН 10,0 – 10,5 (рис. 4)

Рис. 4. Зависимости скорости ферментативной реакции (v) от рН среды.

При экстремальных (очень низких или очень высоких) значениях рН происходит нарушение третичной структуры молекулы фермента, приводящее к потере ферментативной активности.

5. Кинетика ферментативных реакций

Кинетика ферментативных реакций изучает скорости катализируемых ферментами реакций и влияние на них различных факторов.

В простейшем случае ферментативную реакцию можно представить как двухстадийный процесс. К настоящему времени многочисленными экспериментами показано, что первая стадия - это образование фермент-субстратного комплекса (ЕS). Вторая стадия - это превращение фермент-субстратного комплекса через ряд промежуточных состояний в комплекс фермент-продукт и распад этого комплекса на свободный фермент и продукт реакции. Наиболее коротким схематическим способом записи этих стадий является:

Зависимость скорости реакции v от концентрации субстрата С_s описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, где К_м (константа Михаэлиса), а Vмакс (max) - максимальная скорость ферментативной реакции при полном насыщении фермента субстратом:

Графически зависимость скорости реакции от концентрации субстрата представляет полуветвь гиперболы (рис.5):

Рис. 5. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.

При полном насыщении фермента субстратом наблюдается ситуация, когда C_s >> K_м, тогда значением К_м в знаменателе можно пренебречь, и скорость реакции становится максимальной:

v = V_макс

На графике (рис.5) при этом наблюдается плато при высоких концентрациях субстрата.

При полунасыщении фермента субстратом v = V_макс/2. Подстановка этого значения скорости в уравнение Михаэлиса приводит к значению К_м = Cs. Поэтому можно дать следующее определение К_м: константа Михаэлиса - это концентрация субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимальной скорости.

Поскольку в ходе ферментативной реакции наблюдается расходование субстрата и накопление продукта, зависимость их концентраций от времени можно выразить следующим образом (рис. 7):

Рис. 7. Графики зависимости концентрации субстрата и продукта ферментативной реакции от времени.

Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк предложили использовать двойные обратные величины 1/v и 1/C_s, поскольку если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также равны.

Если построить график зависимости 1/v от 1/Сs, получится прямая линия, отсекающая на оси ординат отрезок 1/V_макс, а на оси абсцисс – отрезок, равный -1/К_м.

Рис. 8. График зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, представленный в двойных обратных координатах.