Лекция №18. Ингибирование ионами водорода

При культивировании микроорганизмов весьма часто реализуется ситуация, когда продуктом ферментационного превращения являются органические кислоты, например уксусная или молочная кислоты, которые смещают рН в область низких значений и тем самым изменяют скорость роста культуры. Если ингибирование ионами водорода достаточно сильное, то без специальных приемов вообще невозможно реализовать рост культуры в режиме хемостата.

Проиллюстрируем это на простом примере. Допустим, скорость роста культуры контролируется ионогенной группой с рК~7,0. Это означает, что константа ингибирования Н ⁺ роста культуры K_i=10^-7 М. Из предыдущего раздела следует, что стационарные концентрации субстрата и биомассы в ре­жиме хемостата определяются безразмерным параметром . Если принять K_S~10^-3М (наиболее типичное значение для лимитирующего субстрата — источника углерода) и то при S₀, соизмеримых с K_S, из уравнения (17.54) следует, что S_ст/S₀ = 0,999. Это говорит о том, что субстрат в хемостате практически не конвертируется, роста культуры не происходит.

Для предотвращения ингибирования кислотным продук­том можно, например, в ферментер с постоянной скоростью v₀ подавать нейтрализующий кислоту раствор щелочи опре­деленной концентрации. Рассмотрим стационарную кинетику роста культуры с учетом этого дополнительного процесса.

Кинетику роста культуры описывает система уравнений

(18.1)

(18.2)

(18.3)

Добавочный член v₀ в (18.3) представляет собой молярную скорость ввода в ферментер нейтрализующего раствора (ограничение на v₀ накладывается исходя ).

v₀ = dОН ^- /dτ. (18.4)

Зависимость удельной скорости роста культуры от концентра­ции ионов водорода можно представить в виде

(неконкурентное ингибирование), (18.5)

где функция f(Н⁺) для различных случаев может иметь различный вид. Например, если имеет место сигмоидальная зависимость скорости роста от концентрации ионов водорода

(18.6)

при колоколообразной

(18.7)

В стационарном режиме при имеем

(18.8)

(18.9)

(18.10)

Если рассмотреть простейший случай и предположить, что протон является конкурентным ингибитором роста культуры, то

(18.11)

При подстановке в это уравнение значения Н ⁺ , найденного по уравнению (18.10), получим

(18.12)

откуда следует

(18.13)

Если принять введенное ранее обозначение то уравнение (18.13) можно записать в виде

(18.14)

В отличие от рассмотренного ранее уравнения для случая ингибирования без процесса нейтрализации уравнение (18.14) содержит в числителе дополнительный член . Этот член приводит к тому, что при прочих равных условиях при нейтрализации кислого продукта стационарная концентрация субстрата ниже и соответственно концентрация биомассы выше, чем для процесса без нейтрализации.

В режиме нейтрализации кислоты концентрация биомассы будет представлена уравнением

(18.15)

Дополнительный прирост биомассы при нейтрализации кислот­ного продукта имеет вид

(18.16)

Из этого уравнения видно, что прирост биомассы при нейтрализации кислотного продукта тем выше, чем выше скорость подачи нейтрализующего агента. Прирост биомассы уменьшается с ростом скорости разбавления.

При проведении процесса с нейтрализацией кислотного компо­нента накладываются дополнительные ограничения на скорость разбавления. Из уравнения (18.6) следует, что при , для того чтобы значениеS_ст было положительным, т. е. чтобы величина имела физический смысл, необходимо соблюдение неравенства

(18.17)

Это неравенство будет хорошо выполняться при высоких концентрациях субстрата или при высоких скоростях протока. Критическая скорость разбавления, которая вычисляется на основе равенства нулю числителя уравнения (18.16), имеет вид

(18.18)

Ниже этой величины стационарного роста культуры в хемостате происходить не будет.

Таким образом, в режиме ингибирования ионами водоро­да при нейтрализации кислотного продукта скорость разбавле­ния имеет ограничение как сверху, так и снизу:

(18.19)

Для определения параметров роста культуры в обсуждаемом режиме необходимо провести исследование стационарных уровней субстрата и биомассы при различных концентрациях вводимого субстрата и различных скоростях разбавления.

Зависимость стационарной концентрации субстрата как функции концентрации вводимого субстрата следующая:

(18.20)

Тангенс угла наклона этой зависимости как функции скорости разбавления определяется максимальной скоростью роста орга­низма и α:

(18.21)

В обратных координатах имеем

(18.22)

Эта зависимость позволяет определить значения α и μ_m (или отношение μ_m/α при α>>1).

Отрезок, отсекаемый линейной зависимостью S_ст от S₀ на оси ординат, равен

(18.23)

Если известны значения μ_m, α, v₀ , то из зависимости а от D могут быть найдены К_S и К_i.

Аналогичное рассмотрение может быть проведено для определения параметров роста микроорганизмов из зависимости стационарного уровня биомассы от начальной концентрации субстрата и скорости разбавления.

Заключение по росту микроорганизмов в режиме хемостата

Культивирование микроорганизмов в проточном режиме имеет ряд принципиальных преимуществ по сравнению с периодическим культивированием. Эти преимущества обеспечивают широкое распространение методов проточного культивирования для решения как исследовательских, так и прикладных задач. Основные преимущества связаны с интенсификацией процесса, возможностями осуществить непрерывное культивирование, автоматическим кондиционированием среды, стабилизацией развития клеток в определенной фазе роста. Принципиальной особенностью хемостатного культивирования является управление скоростью роста популяции с помощью скорости разбавления. Увеличение скорости разбав­ления автоматически ведет к установлению в системе новой удельной скорости роста популяции и новых стационарных уровней субстрата, биомассы, продуктов ферментации. Однако следует помнить о принципиальном ограничении, накладываемом на скорость разбавления. При определенной вводимой в ферментер концентрации субстрата она не может быть больше максимальной удельной скорости роста микроорганизма в данных условиях. При скорости разбавления выше критической культура микроорганизмов будет «вымываться» из ферментера.

Уравнения, описывающие рост популяции в режиме хемостата, наиболее просты. Для определения параметров роста, таких, как удельная максимальная скорость роста и константа сродства к субстрату, необходимо исследовать поведение системы при различных скоростях разбавления или различных начальных концентрациях субстрата и использовать уравнения, которые следуют из изложенной теории хемостатного роста. Соответствие экспериментальных данных уравнениям для случая неосложненного роста является доказательством того, что рост популяции протекает в условиях отсутствия осложняющих эффектов. Если наблюдаются существенные отклонения от уравнений «идеального» роста, то необходимо провести идентификацию осложняющего эффекта. Это может быть как ингибирование избытком субстрата, так и ингибирование продуктом культивации микроорганизма.

В случае неосложненного роста стационарная концентрация субстрата должна сильно возрастать с ростом скорости разбавления, в то время как при сильном ингибировании субстратом она может как линейно расти, так и сильно падать. При ингибировании продуктом стационарная концентрация субстрата должна расти с ростом скорости разбавления по гиперболическому закону. Напротив, в случае ингибирования продуктом должна наблюдаться линейная зависимость между стационарной концентрацией субстрата в ферментере и в питающем его растворе. Совершенно различны закономерности изменения в ферментере биомассы при изменении скорости разбавления. На основании качественного сопоставления экспериментальных данных с теоретическими, представленными можно идентифицировать условия роста популяции, определить в последующем параметры процесса и найти наиболее опти­мальные условия его проведения.