Федеральное агентство по образованию российской федерации фгоу впо «Восточно-Сибирский государственный технологический университет»

КОНСПЕКТ

лекций по курсу «Теоретические основы биотехнологии» для студентов специальности 240901 «Биотехнология»:

ПИТАНИЕ И КИНЕТИКА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ

Составитель: Балдаев Н.С.

Улан-Удэ, 2009

Лекция № 1. Введение. Питание микроорганизмов.

Современная биотехнология – комплексная многопрофильная область научно-технического прогресса, включающая такие разделы, как микробиологический синтез в его широком понимании; генная и клеточная инженерия; инженерная энзимология. Бактерии, дрожжи, плесневые грибы, морские водоросли, клетки и ткани высших растений и животных, или ферменты, выделенные из этих организмов, являются исходными объектами для развития новых отраслей промышленности, а также замены существующих химических процессов новыми или улучшенными микробиологическими процессами. Сюда относится также использование биотехнологических процессов для производства энергии из различных видов сырья и топлива.

Биотехнология является одним из приоритетных направлений науки и техники, ее развитию уделяют большое внимание. Так, например, в США с биотехнологией связывают решение проблем в энергетической, сырьевой, продовольственной и экологической областях, определены ее основные направления такие как:

- биоконсервация солнечной энергии;

- применение микроорганизмов для повышения выхода нефти и выщелачивания цветных и редкоземельных металлов;

- замена дорогостоящих химических катализаторов и получение принципиально новых соединений;

- применение бактериальных стимуляторов роста растений;

- направленный биосинтез для получения новых биологически активных препаратов – аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков, различных пищевых добавок и фармацевтических продуктов.

Признав стратегическую важность развития биотехнологии, а также существующее отставание Японии в этой области от ведущих стран, в частности США, японское правительство с 1974 года приступило к форсированию биотехнологических исследований в стране. В 1975 году министерство внешней торговли и промышленности выделило на проведение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ 6 млрд. иен. Через 10 лет правительство декларировало коммерциализацию биотехнологии национальным приоритетом. В настоящее время Япония производит продукты микробиологического синтеза на сумму 11-12 трлн. иен, что составляет около 5% от совокупного национального продукта. Достижения страны в микробиологической промышленности заключаются в массовом и сравнительно дешевом производстве ценных продуктов, а именно: широкого спектра антибиотиков, вакцин, медицинских препаратов для людей и животных; средств защиты растений; удобрений; аминокислот; витаминов; жиров; ферментов; белков.

Специалисты министерства внешней торговли и промышленности Японии видят долгосрочные перспективы развития биотехнологии в следующих областях:

- ферментация (производство и хранение пищевых продуктов, производство кормов, химикатов, лекарств);

- биосенсоры (медицинская диагностика, индикация вредных веществ в пищевой промышленности и окружающей среде);

- белковая инженерия (создание фармацевтических препаратов, биочипов, катализаторов);

- культура клеток (производство моноклональных антител для диагностики и терапии, создание новых сортов растений, производство фармацевтических препаратов, селекция животных);

- рекомбинантные ДНК (создание новых организмов с заданными свойствами, лекарственных препаратов, базовых элементов для электроники, средств диагностики и идентификации различных веществ).

Одним из разделов государственной научно-технической программы Республики Беларусь является «Биотехнология животноводству и ветеринарии» в котором большое внимание уделено вопросу производства кормовых добавок и препаратов ветеринарного назначения (вакцины, сыворотки, диагностикумы, антибактериальные и лечебно-профилактические препараты).

В России по данным за 1-ое полугодие 1997 г. предприятиями биотехнологической отрасли было выпущено товарной продукции (в основном кормовой микробный белок, спирт и хлебопекарные дрожжи) на сумму 915,5 млрд. неденоминированных рублей. В 2001 году на 15 биотехнологических предприятиях было произведено свыше 90 тыс.т. кормового микробиологического белка.

В 2004 г. приняты «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники РФ» которые включают в себя 9 направлений по различным отраслям народного хозяйства, в том числе направление «Технология живых систем». В «Перечень критических технологий РФ» входят технологии связанные с использованием живых организмов.

Таким образом биотехнология на протяжении последних 30 лет является одним из приоритетных направлений науки и техники. В высших учебных заведениях Российской Федерации открыты специальности по различным направлениям биотехнологии. В том числе и в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете.

Дисциплина «Теоретические основы биотехнологии» относится к циклу специальных дисциплин и является основополагающей по отношению к остальным дисциплинам цикла. Государственным образовательным стандартом на изучение данной дисциплины отведено 180 часов, из них 45 часов лекций, 30 часов лабораторных занятий и 15 часов практических занятий. 90 часов отводится на самостоятельную подготовку.

Для успешного усвоения курса «Теоретические основы биотехнологии» необходимо иметь хорошие знания дисциплин из цикла естественно-научных и общепрофессиональных, таких как математика, физическая химия, биохимия, микробиология, общая химическая технология, процессы и аппараты химических технологий.

1. Питание микроорганизмов.

Микроорганизмы, как и все другие живые существа, нуждаются в пище, которая поступает в их клетки из окружающей среды. Пищей обычно называют вещества, которые, попав в живой организм, служат либо источником энергии для процессов жизнедеятельности, либо материалом для построения составных частей клетки.

Потребность в питательных веществах микроорганизмы могут удовлетворять непосредственно усваивая их или предварительно преобразуя в доступную форму. Известны два способа питания живых существ — голозойный и голофитный.

При голозойном способе питания живой организм захватывает или заглатывает плотные частицы пищи, которая затем переваривается в пищеварительном тракте. Указанный способ питания характерен для животных (от простейших до высших). При голофитном способе питания живые существа, не имеющие специальных органов для заглатывания и пищеварения, используют питательные вещества, всасывая их в виде относительно небольших молекул из водного раствора. Данный способ питания свойствен растениям и микроорганизмам.

Полимерные органические соединения (полисахариды, белки и др.) микроорганизмы не могут поглощать и использовать непосредственно в обмене веществ клетки. Такие вещества должны быть вначале расщеплены на простые соединения, для которых клеточ­ная мембрана проницаема. Крупные молекулы расщепляются экзоферментами, экскретируемыми клетками микроорганизмов в среду. Такое внешнее, или внеклеточное, переваривание свойственно только микроорганизмам.

Поступление воды и растворенных в ней питательных веществ из окружающей среды внутрь микробной клетки, а также выход продуктов обмена происходят через клеточную стенку, капсулу и слизистые слои. Капсула и слизистые слои представляют собой достаточно рыхлые образования и, возможно, не оказывают значительного влияния на транспорт веществ, тогда как клеточная стенка служит существенным барьером для поступления питательных соединений в клетку.

Активную роль в поступлении в клетку питательных веществ играет цитоплазматическая мембрана. Чтобы обеспечить нормальную жизнедеятельность микроорганизма, последняя должна быть проницаемой для питательных веществ и кислорода, поступающих в клетку, а также для продуктов обмена, выходящих наружу. Поступление воды и растворенных в ней веществ через цитоплазматическую мембрану — активный процесс: живая микробная клетка никогда не находится в равновесии с веществами окружающей среды, проходящими через ее мембрану.

Транспорт питательных веществ. Выделяют несколько типов транспортных систем, при помощи которых вещества из окружающей среды проходят через цитоплазматическую мембрану: пассивную диффузию, облегченную диффузию, активный транспорт и перенос групп (радикалов). Причем два из них (пассивная и облегченная диффузия) обеспечивают только транспорт, но не накопление веществ в микробной клетке, в то время как активный транспорт способствует аккумуляции веществ внутри клетки.

При пассивной диффузии транспорт вещества происходит через цитоплазматическую мембрану под действием разности концентраций (для неэлектролитов) или разности электрических потенциалов (для ионов) по обе стороны мембраны. Экспериментами показано, что, за исключением воды, только кислород и некоторые ионы проходят через цитоплазматическую мембрану в результате пассивной диффузии. Скорость такого переноса веществ весьма незначительна. Определенное значение пассивная диффузия приобретает при нарушениях жизнедеятельности бактериальной клетки.

Транспорт большинства растворенных веществ осуществляется через мембрану при действии специальных механизмов переноса. Для этого служат молекулы-переносчики, циркулирующие между внешним и внутренним пограничными слоями цитоплазматической мембраны. Считают, что данные переносчики связывают молекулы растворенных веществ на ее внешней стороне, транспортируют их к внутренней, где освобождают, и молекулы питательного вещества поступают в цитоплазму без изменения. Такие связанные с цитоплазматической мембраной переносчики, представляющие собой субстратспецифичные связывающие белки, называют пермеазами, или транслоказами.

Транспорт растворенных веществ, осуществляемый переносчиками, может быть в виде облегченной диффузии и активного транспорта. Движущей силой облегченной диффузии служит разница в концентрации какого-либо вещества по обе стороны мембраны. Молекула вещества соединяется с молекулой-переносчиком у наружной поверхности мембраны, и образовавшийся комплекс диффундирует через мембрану к ее внутренней стороне. Там он диссоциирует, и освобожденное вещество оказывается внутри клетки. Затем переносчик диффундирует к наружной поверхности и может присоединить новую молекулу вещества.

Облегченная диффузия не требует расхода энергии, если наружная концентрация вещества выше внутренней, так как оно пере­мещается «вниз» по химическому градиенту. Скорость процесса зависит от концентрации вещества в наружном растворе. Предполага­ют, что выход продуктов обмена веществ из микробной клетки также происходит по типу облегченной диффузии при участии переносчиков.

Активный транспорт связан с работой специфических транспортных белков (пермеаз, транслоказ и др.), которые также находятся в цитоплазматической мембране. В этом случае растворенные вещества переносятся в клетки микроорганизмов «вверх» по химическому градиенту (или против градиента концентрации). Считают, что большинство веществ проникает в клетку микроорганизма в результате активного транспорта. Источниками энергии для транспортных процессов служат АТФ, протонный потенциал и фосфоенолпируват. Существуют системы «первичного» и «вторичного» ак­тивного транспорта.

В системах «первичного» активного транспорта используется химическая энергия. Необходимость использования энергии для поддержания активного транспорта объясняется теми изменениями, которые претерпевает переносчик: когда он обращен к внешней поверхности мембраны, то обладает высоким сродством к субстрату, а когда к внутренней — низким сродством к субстрату. Возмож­ность транспортировать вещества против градиентов концентраций часто используется клетками бактерий для получения этих веществ из окружающей среды, где их концентрация мала, что обычно для природных условий. При отсутствии источников энергии накопления веществ внутри не происходит.

Подсчитано, что перенос молекулы тиогалактозида через цитоплазматическую мембрану кишечной палочки требует затраты одной молекулы АТФ. Предполагая, что активный перенос других соединений связан с подобным же расходом АТФ, можно понять, какое значительное количество энергии на транспорт веществ в клетку потребляет растущий и размножающийся микроорганизм. В отдельных случаях на активный транспорт может затрачиваться почти вся энергия, вырабатываемая в микробной клетке.

В системах «вторичного» активного транспорта для переноса против градиента концентрации через мембрану многих веществ, в том числе неорганических и органических ионов, сахаров, используется энергия протонного потенциала. В процессе дыхания в лока­лизованной в мембране дыхательной цепи осуществляется вывод протонов. В результате перемещения протонов через мембрану за счет энергии дыхания создается градиент электрохимического потенциала (называемый также протонным потенциалом, или протондвижущей силой) между наружной и внутренней сторонами мембраны. Протонный потенциал обусловливает фосфорилирование, т. е. синтез АТФ, или используется непосредственно транспортными системами. Протонный потенциал (Δр) определяется мембранным потенциалом (Δψ), имеющим отрицательное значение внутри клетки, и градиентом протонов (ΔрН), имеющим внутри клетки щелочной показатель в соответствии с уравнением

Δр = Δψ – z·ΔрН (мВ),

где z = 59 мВ при 25 °С.

Для поддержания протонного потенциала микроорганизм не­прерывно выкачивает за пределы своей клетки протоны и другие ионы (Na⁺). В этих целях используются специфичные транспортные белки, имеющиеся в мембране. Каждому транспортному белку присуща определенная функция. Способность белка катализировать одновременный и однонаправленный транспорт одного протона и одной молекулы субстрата, например сахара (лактозы, глюкозы и др.), называют симпортом. Унипорт наблюдается, когда белок осуществляет перенос только одного субстрата (без протона), антипорт — когда он осуществляет перенос двух разных субстратов, обычно ионов, в противоположных направлениях.

У многих микроорганизмов сахара (фруктоза, глюкоза и другие родственные вещества) транспортируются в клетку при помощи фосфотрансферазной системы переноса групп (радикалов). Данный процесс отличается от активного транспорта тем, что субстрат попадает внутрь бактериальной клетки в химически модифицированной форме — чаще всего в виде фосфатного эфира. Движущая сила рассматриваемого процесса состоит в том, что внутри цитоплазматической мембраны сахар связывается в результате реакции с фосфорилированным ферментом (фосфотрансферазная система, источником энергии в этой реакции служит фосфоенолпируват), образующийся в итоге фосфорный эфир освобождается и поступает в цитоплазму. Химическая природа транспортируемого вещества при переносе не меняется.

Таким образом, удовлетворение пищевых потребностей микроорганизмов зависит не только от внутреннего комплекса ферментов, необходимого для утилизации определенных соединений, но и от действия специфических транспортных механизмов.

Основную часть микробной клетки составляет вода (80—90% общей массы). В состав клеток микроорганизмов входят следующие эле­менты (% массы сухого вещества): углерод — 50; кислород — 20; азот — 14; водород — 8; фосфор — 3; сера — 1; калий — 1; натрий — 1; кальций — 0,5; магний — 0,5; хлор — 0,5; железо — 0,2; другие элементы — 0,3. В очень небольших количествах в состав клетки входят микроэлементы цинк, медь, кобальт, стронций, марганец и др.

Для биосинтеза основных макромолекул клетки, из которых формируются клеточная стенка, мембраны, нуклеоид, цитоплазма и другие компоненты, микроорганизмы должны получать все эти элементы в составе источников питания.

Помимо питательных элементов, используемых для построения структурных частей клетки, микроорганизмы нуждаются в постоянном источнике энергии, которая расходуется на биосинтез, транспорт веществ и другие жизненные процессы в клетке.