- •Принципы организации и оборудования микробиологической лаборатории, правила работы в ней
- •5Окраска по Граму. Методика:
- •Светлопольная микроскопия
- •Темнопольная микроскопия
- •Темнопольная микроскопия
- •Фазовоконтрастная микроскопия
- •Люминесцентная микроскопия
- •Электронная микроскопия
- •Структурные элементы бактериальной клетки:
- •Цитоплазматическая мембрана
- •Периплазматическое пространство
- •Цитоплазма
- •Мезосомы
- •Нуклеоид
- •Клеточная стенка
- •Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных прокариот
- •Клеточная стенка
5Окраска по Граму. Методика:
окрасить мазок генцианвиолетом ( 2 минуты,через фильтровальную бумагу);
бумагу удалить, оставшуюся краску слить;
окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);
раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);
тщательно смыть спирт водой;
окрасить водным фуксином (2 минуты);
промыть водой и высушить.
Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – вкрасный Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:
нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);
бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);
тщательно промыть водой;
окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);
промыть водой и высушить.
Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. Метод Ожешко.
нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);
слить кислоту, промыть водой, высушить;
зафиксировать в пламени;
окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.
Окраска включения волютина (по Нейссеру).
Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);
Промыть;
Окрасить раствором Люголя (30 секунд);
Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)
Промыть препарат и высушить
Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Бурри (обнаружение капсул).
Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с не окрашенными бактериями.
Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;
Высушить на воздухе и бактериоскопировать.
Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.
№6 Устройство светового микроскопа и техника иммерсионной микроскопии.