Хід роботи.
1. Колбу з суспензією струсити і відібрати піпеткою декілька мл суспензії.
2. 1 мл суспензії змішати з 2 мл 8 % оксиду хрому і поставити на 15 хвилин в термостат при температурі 700С.
3. Суміш пропустити 3 рази через шприц з товстою голкою.
4. Камеру Фукса-Розенталя заповнити суспензією.
5. Підрахувати клітини під мікроскопом.
6. Густину суспензії розрахувати по формулі:
де Х - число клітин в мл,
М - середнє число клітин в камері,
n - розведення.
Робота 3. Визначення міри агрегації і життєздатності суспензії. Теоретичні відомості
Залежно від мети дослідження умови культивування склад поживного середовища підбирають так, щоб в суспензії переважала певна фракція клітин. Зазвичай в суспензії розрізняють 4 основних фракції: поодинокі клітини, дрібні агрегати, середні агрегати, великі агрегати. Міру агрегації визначають, підраховуючи клітини в декількох полях зору на тимчасових препаратах під малим збільшенням мікроскопа (не менше 1000 клітин).
При роботі з суспензіями необхідно враховувати і її життєздатність. Про життєздатність клітин можна судити за рухом цитоплазми, по мірі проникності клітинної стінки для барвників, за активністю ферментів.
Прижиттєві барвники, такі як метиленовий синій, клітини не вбивають і через оболонки живих клітин в цитоплазму не проникають. Суспензія рахується життєздатної, якщо більше 70 % клітин не забарвлюються в синій колір; агрегат життєздатний, якщо більше 50 % його клітин не забарвилися.
Для кількісного визначення життєздатності суспензії використовують речовини, що беруть участь в метаболізмі клітини: флуоресцеїндіацетат розщеплюється в клітині естеразами з утворенням флуоресцеїну, що дає флуоресценцію цитоплазми живих клітин. Активність естерази визначають на спектрофотометрі. Фарбування клітини солями тетразоля дозволяє визначити інтенсивність дихання клітини.
Матеріали і устаткування. Мікроскоп, флакон з 0,1 % розчином метиленового синього, предметні і покривні скельця, фільтрувальний папір, дистильована вода, марлеві серветки, піпетки.
Хід роботи.
1. Приготувати препарат суспензії : струсити суспензію в колбі, піпеткою відібрати невелику кількість суспензії, помістити краплю суспензії на предметне скло, додати краплю барвника, накрити покривним склом, надлишок рідини забрати фільтрувальним папером.
2. Помістити препарат на столик мікроскопа під мале збільшення об’єктиву і підрахувати клітини і агрегати в 3-х полях зору (проглянути не менше трьох препаратів).
3. Результати записати в таблицю.
4. Один препарат замалювати, описати морфологію клітин суспензії (форму, розмір).
5. Зробити висновок про міру агрегування суспензій (які фракції переважають, %) і життєздатності суспензії (незабарвлених клітин, %).
Таблиця.
Ступінь агрегації і життєздатності суспензії.
|
Фракції |
Препарати | ||||||||||||||||||
|
1 |
2 |
3 | |||||||||||||||||
|
Поля зору | |||||||||||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 | |||||||||||
|
з |
н |
з |
н |
з |
н |
з |
н |
з |
н |
з |
н |
з |
н |
з |
н |
з |
н | ||
|
поодинокі клітини |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
дрібні агрегати (2-5 клітин) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
середні агрегати (6-20 клітин) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
великі агрегати (21-50 клітин) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
дуже великі агрегати (50 і більше клітин) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
Примітка: з – забарвлені клітини та агрегати,
н – незабарвлені клітини та агрегати.
Робота 4. ОТРИМАННЯ КЛІТИННИХ КЛОНІВ НА АГАРИЗОВАНИХ СЕРЕДОВИЩАХ. МЕТОД ПЛЕЙТИНГА.