Тема 2: гістологічна техніка

Зміст

Основні принципи приготування препаратів для світлової і електронної мікроскопії, взяття матеріалу (біопсія, пункції, аутопсія). Фіксація, обезводнення, ущільнення об'єктів, приготування зрізів на мікротомах і ультрамікротомах. Види міпрепаратів - зріз, мазок, відбиток, плівки, шліф. Забарвлення і контрастування препаратів. Поняття про гістологічні барвники.

Мікроскопічна техніка.

Головні етапи цитологічного і гістологічного аналізу:

- вибір об'єкту дослідження

- підготовка його для вивчення в мікроскопі

- застосування методів мікроскопування

- якісний і кількісний аналіз отриманих зображень

Методи, що застосовуються в гістологічній техніці:

1. Прижиттєві.

2. Посмертні.

I прижиттєві методи

Метою прижиттєвих досліджень є отримання інформації про життєдіяльність клітини: рух, ділення, зростання, диференціювання, взаємодія клітин, тривалість життя, руйнування, реактивні зміни під дією різних чинників.

Дослідження живих клітин і тканин можливо поза організмом (in vitro) або усередині організму (in vivo).

А. Исследовані живих клітин і тканин в культурі (in vitro) – метод культивування

Розрізняють: а) суспензійні культури (клітини, зважені в живильному середовищі), б) тканинні, в) органні, г) багатошарові

Метод культивування тканини поза організмом є найпоширенішим. Культивувати тканину можна в спеціальних прозорих герметично закритих камерах. У стерильних умовах в камеру поміщають краплю живильного середовища. Якнайкращим живильним середовищем є плазма крові, до якої додають ембріональний екстракт (витяжка з тканин зародка, що містить велику кількість речовин, стимулюючих зростання). Туди ж поміщають шматочок органу або тканини (не більше 1 мм3), які необхідно культивувати.

Витримувати культивовану тканину слід при температурі тіла організму, тканина якого узята для дослідження. Оскільки поживне середовище швидко приходить в непридатність (у ній накопичуються продукти розпаду, що виділяються культивованою тканиною), то кожні 3-5 днів її потрібно міняти.

Використання методу культивування дозволило виявити ряд закономірностей диференціювання, злоякісного переродження клітин, взаємодій клітин між собою, а також з вірусами і мікробами. Культивування ембріональних тканин дозволило вивчити розвиток кісток, хряща, шкіри і ін.

Особливу значущість метод культивування має для проведення експериментальних спостережень на клітинах і тканинах людини, зокрема для визначення статі, злоякісного переродження, спадкових захворювань і ін.

Недоліки методу:

1. Головним недоліком цього методу є те, що тканина або орган досліджується у відриві від організму. Не піддаючись нейрогуморальному впливу організму, вона втрачає властиве нею диференціювання.

2. Необхідність частих пересадок (при тривалому культивуванні).

3. Однаковий коефіцієнт променезаломлення тканин.

Б. Прижиттєві дослідження клітин в організмі (in vivo)

1. Спостереження структур в живому організмі. Приклад: за допомогою спеціальних мікроскопів-ілюмінаторів, що просвічуються, можна спостерігати циркуляцію крові в мікросудинах.

2. Метод імплантації прозорих камер в організм тварини. Досліджуваний об'єкт поміщається в прозору камеру (забезпечену мікроотворами для здійснення обміну речовин) і імплантується, найчастіше, у вушну раковину експериментальної тварини. За допомогою мікроскопа можна спостерігати динаміку зміни клітин і тканин протягом тривалого часу.

3. Метод використання природних прозорих камер експериментальної тварини, наприклад передньої камери ока, розташованої між рогівкою і радужкою. Такий метод був використаний для вивчення ранніх стадій розвитку зародка, циклічних змін ендометрія і ін.

4. Метод трансплантації – широко використовується для вивчення кровотворення. Клітини крові і кісткового мозку від здорових тварин пересаджують тваринним, що піддаються смертельному опромінюванню. Експериментальні тварини виживають унаслідок того, що приживляються донорських клітин, створюючих в селезінці колонії кровотворних клітин (метод колонеутворення). Цим методом встановлені джерела розвитку для всіх клітин крові.

Оскільки тканини в організмі мають приблизно однаковий коефіцієнт променезаломлення, то іноді з метою їх диференціювання удаються до використання прижиттєвих барвників.

До прижиттєвих барвників відносяться: метиленовий синій, трипановий синій, конго-червоний.

Прижиттєві барвники повинні відповідати наступним вимогам:

1. Бути нешкідливими для організму.

2. Швидко виводитися з організму.

Забарвлення живих об'єктів має два різновиди:

1. Вітальне (прижиттєве забарвлення) - барвник вводять в організм тварини, де він вибірково зв'язується з певними клітинами, органелою, міжклітинною речовиною. Наприклад, трипановий синій або літієвий кармін виявляють фагоцити; алізарин – новоутворений матрикс кістки.

2. Суправітальноє забарвлення – забарвлення живих клітин, виділених з організму. У такий спосіб барвником діамантовим крезиловим синім виявляються молоді еритроцити (ретикулоцити), янусом зеленим – мітохондрії, нейтральним червоним – лізосоми.