4. Получение действующего биологического начала (посевного материала)

Штаммы-продуценты микробиологические предприятия получают из академий и университетов в пробирках на скошенном агаре или в ампулах. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, характеристики среды для культивирования и хранения.

Чистой культурой называется культура одного вида бактерий. Выделение чистой культуры в ряде случаев представляет весьма сложную задачу. В то же время получение чистой культуры является необходимым условием, т.к. только имея один вид бактериального организма, можно изучить его морфологию, развитие и физиолого-биохимические свойства. Для выделения чистой культуры обычно используют различные виды питательных сред.

Чистые культуры получают для бактерий, грибов, водорослей и т.п. Особенно большое практическое значение имеют чистые культуры дрожжей в пивоваренном производстве, т.к. сусло, используемое для приготовления пива, заражается чистой культурой дрожжей.

Кроме чистых культур, известны и так называемые элективные (накопительные) культуры. При постановке элективных культур исходят из биологических особенностей данного вида или экологической группы микроорганизмов.

Элективные культуры – основной способ выделения бактерий из почвы, где имеется огромное число микроорганизмов. Из элективной культуры легко выделить чистую культуру даже на жидких питательных средах. Таким образом, элективной культурой называется такая, при которой из огромного числа форм, имеющихся в материале и служащем для заражения (почва, навоз, другие субстраты), развивается только один вид или группа близких форм.

Проточные культуры.

Для наиболее успешного культивирования микробов, что особенно важно для выращивания их в условиях производства или лаборатории, применяется непрерывная (или проточная) культура.

В специальный сосуд - культиватор все время притекает свежая среда и с такой же скоростью вытекает культуральная жидкость вместе с клетками. Жидкость в культиваторе должна перемешиваться для того, чтобы обеспечить одинаковые условия во всем сосуде.

5. Ферментация (образование целевого продукта)

Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, т.к. в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов. Эта стадия осуществляется в биотехнологическом реакторе (ферментере) и может быть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта.

Ферментер – это реакционная емкость, в которой обеспечивается питательное и физиологическое окружение культуры, необходимое для ее роста или получения нужных продуктов метаболизма.

Принципы оснащения биопроизводств:

1. Конструкционное совершенство и относительная универсальность биоректоров.

2. Инертность и коррозионная стойкость материалов биореакторов, другого технологического оборудования, влияющих на биообъект или контактирующих с ним или продуктами его метаболизма.

3. Эксплуатационная надежность технологического оборудования.

4. Доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены, очистки, обработки антисептиками и дезинфектантами узлов и соответствующих частей оборудования.

Биореакторы подразделяются на:

• аппараты для выращивания посевного материала – инокуляторы;

• аппараты для культивирования микроорганизмов – культиваторы, ферментаторы, ферментеры больших объемов (до 200 м³);

• аппарат для выращивания растительных клеток – фитатрей– мембранный контейнер для выращивания растительных клеточных культур.

• биореакторы для выращивания животных клеток относительно небольшого объема (до 10 л) с вибромешалками или медленными (щадящими) пропеллерными мешалками.

В зависимости от конструкционных особенностей биореакторов их классифицируют следующим образом.

Промышленные биореакторы могут работать в:

• периодическом режиме;

• периодическом режиме с доливом субстрата;

• полунепрерывном (полупериодическом) режиме;

• непрерывном (проточном) режимах.

Исторически в промышленности утвердился периодический способработы при осуществлении химических превращений иполунепрерывный– при получении микробной биомассы. В последнее время для химических превращений стали применятьреакторы с периодическим режимом и с доливом субстрата, а для получения микробной биомассыреакторы, работающие внепрерывном проточномрежиме. Традиционно биореакторы, работающие в непрерывном проточном режиме,, использовались в промышленном масштабе только для аэробной переработки сточных вод и отходов, а также при производстве уксуса.

Детальный анализ некоторых потенциальных режимов работы биореакторов указывает на превосходство проточного непрерывного режима по сравнению с периодическими режимами работы.

При работе по периодическому режимув реактор загружают все необходимые компоненты, ведут процесс до конца и затем собирают конечный продукт.

Периодический режим с добавлением субстратапредусматривает периодическое или непрерывное введение субстрата без удаления конечного продукта, который собирают только по завершению процесса.

При полунепрерывном ведении процесса, который также называют полупериодическим, по завершении начальной стадии в периодическом режиме наполовину опорожняют, чтобы частично собрать продукт, а затем снова заполняют таким же объемом свежей среды, и доводят процесс до конца; а затем снова осуществляют ту же последовательность операций. Подобный подход направлен на лучшее использование производственной установки.

1. По способу потребления энергии для диспергирования и перемешивания стерильного воздуха.

I тип - энергия расходуется на механическое движение внутренних устройств (ферментатор периодического действия);

II тип - энергия расходуется на работу внешнего насоса, обеспечивающего рециркуляцию жидкости и/или газа (ферментатор с внешним насосом);

III тип - энергия расходуется на сжатие и подачу газа в культуральную жидкость (ферментатор с эрлифтом).

2. По способу смешения газожидкостных фаз:

Барботажные, эрлифтные, барботажно-эрлифтные, перемещивающе-барботажные, барботажные с циркуляционным перемешиванием, с роторным перемешиванием и аэрацией и т.п.

3. По способу ввода энергии для перемешивания:

а) с подводом энергии газовой фазой (барботажный, эрлифтный, форсуночный);

б) с подводом энергии жидкой фазой (эжекционный, с всасывающей мешалкой);

в) комбинированные (барботажный с механическим перемешиванием).

В любом биореакторе или ферментере присутствуют следующие основные системы:

1. система перемешивания и аэрации;

2. система теплообмена;

3. система пеногашения;

4. система стерилизации.

По способу перемешивания и аэрации ферментеры подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием.

Аппараты с механическим перемешиванием:

Эти аппараты имеют механическую мешалку, состоящую из центрального вала и лопастей (6 – 8) различной формы (прямых или изогнутых). Эффективное перемешивание жидкости в больших объемах обеспечивается только в том случае, если мешалки многоярусны, лопасти расположены в несколько этажей. В систему перемешивания входят также отражательные перегородки – узкие металлические пластины, прикрепленные к внутренним стенкам реактора. Эти перегородки предотвращают возникновение водоворота вокруг вращающейся мешалки, переводя круговое движение жидкости в вихревое, равномерно распределенное по всему объему.

Аппараты с механическим перемешиванием – наиболее распространенная конструкция в современной микробиологической промышленности. Перспективы их дальнейшего применения связаны с высокой скоростью массопередачи кислорода и значительной экономии мощности.

Аппараты с пневматическим перемешиванием.

В аппаратах этого типа мешалка отсутствует, перемешивание жидкости осуществляется пузырьками газа. Простейший аппарат подобного типа – барботажная камера, в которой распыленный барботером воздух, поднимаясь снизу вверх, перемешивает культивационную среду. Скорость массопередачи между газом и жидкостью в таком аппарате намного ниже, чем в аппаратах с механическим перемешиванием. Для устранения этого недостатка вводятся различные модификации. Перемешивание и аэрация усиливаются с помощью вращающихся дисков с отверстиями, установленных вблизи барботера, или с помощью придонных пропеллеров.

Аппараты с циркуляционным перемешиванием.

Биореакторы циркуляционного типа содержат устройства (насосы, эжекторы), создающие направленный ток жидкости по замкнутому контуру. Жидкость увлекает за собой пузырьки газа. Насос для циркуляции культуральной жидкости может соседствовать с барботером.

Система теплообмена:

Микроорганизмы могут эффективно расти в определенных температурных условиях, поэтому необходимо создать во всем объеме биореактора оптимальную температуру с помощью специальных устройств (например, с помощью специальных труб, по которым подается либо охлаждающий, либо нагревающий агент, и которые иногда оплетают ферментер в виде рубашки или внутри ферментеров устанавливаются змеевики). Для охлаждения используют артезианскую воду или воду, пропущенную через охлаждающие агенты, например, фреоны. В качестве нагревательных агентов используют пар, горячую воду.

Система пеногашения – это специфическая аппаратурная система, характерная для биологических процессов, т.к. реализация таких процессов сопровождается вспениванием культуральной жидкости в результате ее перемешивания. Пену образуют белки, мыла и др.

В некоторых случаях пенный слой благоприятен для культивирования, например, при культивировании дрожжей, т. к. в данном случае пена играет роль кислородного коктейля.

Неблагоприятное явление – это избыточное пенообразование, т.к. в данном случае возможна микробная контаминация, а пеногашение – это средство борьбы с избыточным пенообразованием.

Существуют химический, механический, акустический и другие виды пеногасителей.

Химические пеногасители – это чаще всего поверхностно-активные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей воздуха, становятся центрами их неустойчивости. Виды химических пеногасителей: растительные масла (соевое, подсолнечное, горчичное), животные масла (рыбий жир), минеральные жиры, но коварство этих пеногасителей состоит в том, что продукты их утилизации микробной культурой сами способствуют пенообразованию. Преимущество жиров – в совмещении ими двух функций: они гасят пену и одновременно служат ценными субстратами. Вышеперечисленные пеногасители довольно дорогие, поэтому на практике чаще используют синтетические пеногасители, такие, например, как силиконовые масла, полимерные многоатомные спирты, полиэфиры.

Механические пеногасители – это различные механические устройства, которые сбивают пену (лопасти, диски и т.п.). Обычно их располагают по периметру в верхней части ферментера. К более сложным приспособлениям относятся сепараторы пены, используемые также при сборе биомассы, содержащеся в пенном слое. Применение таких устройств означает дополнительные энергозатраты. Именно в интересах их минимизации часто прибегают к совместному использованию механических и химических пеногасителей.

Система стерилизации – это специфическая система, характерная для биотехнологических процессов. Выделяют следующие основные виды стерилизации: термический, химический, фильтрационный, радиационный.

Метод	Область применения
Термический:	Основной метод стерилизации биореакторов, питательных сред и добавок, вспомогательного оборудования и фильтров для стерилизации воздуха
острым паром	Стерилизация аппаратов и сред
глухим паром	Стерилизация некоторых питательных сред или их компонентов (например, масел)
паром, генерируемым в самом сосуде, подлежащем стерилизации	Стерилизация биореакторов и сред, если последние не пригорают к нагревателю
в автоклаве	Стерилизация некоторых лабораторных биореакторов, небольших объемов жидкости, мелких элементов вспомогательного оборудования
Химический	Стерилизация питательных сред, в основном для лабораторных биореакторов
Фильтрационный	Стерилизация поступающего в биореактор воздуха/газа, в меньшей степени используют как мягкий метод стерилизации жидких сред без взвесей
Радиационный	Не получил распространения