Часть 1. Клеточная инженерия.

Слайд 1. Направления клеточной биотехнологии:

1. Гибридомная технология.

2. Выведение новых и улучшение существующих сортов растений и штаммов микроорганизмов.

3. Клеточные ассоциации.

Основой клеточной инженерии является гибридизация (слияние) соматических клеток с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным или же клетка-реципиент может приобрести отдельные части клетки –донора: цитоплазму, органеллы, ядерным геном или его блоки.

Слайд 2. С помощью клеточной инженерии мы получаем возможность:

1. Скрещивать филогенетически отдаленные формы живого.

2. Получать ассиметричные гибриды, несущих полный набор генов одного из родителей и частичный набор другого родителя. Такие гибриды устойчивее и плодовитее

3. Получать гибриды путем слияния трех и более родительских клеток с образованием растений или грибов - регенерантов.

4. Также получили возможность слияния клеток различных тканей и органов; и нормальных клеток с опухолевыми клетками с образованием гибридом.

Гибридомная технология, на сегодняшний день, наиболее перспективное направление клеточной инженерии. Основная цель – продлить жизнь клетке, продуцирующей ценные вещества путем слияния с раковыми клеткой и клонирование полученной гибридомной клеточной линии.

Гибридомы получают на основе клеток – представителей различных царств живого.

Слайд 3. Наибольшее практическое значение имеют продукты слияния клеток злокачественных опухолей иммунной системы (миелом) с нормальными клетками той же системы. При слияние В-лимфоцита с миеломной клеткой получаются В-гибридомные клоны или моноклональные антитела.

Слайд 4. Моноклональные антитела однородны по своим свойствам, обладают одинаковым сродством к антигену и связываются с одной единственной антигенной детерминантой. Недостатки: не стабильны при хранении в высушенном состоянии, нередко имеют слишком низкое сродство к антигену и чрезмерно узкую специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов; высокая стоимость на мировом рынке.

Моноклональные антигены широко используются для распознавания и лечения заболеваний, вызываемых бактериями, грибами, вирусами, токсинами, аллергенами и раковыми опухолями. Они успешно применяются в аналитических целях.

2 Направление клеточной инженерии - Выведение новых и улучшение существующих сортов растений и штаммов микроорганизмов.

Перспективы клеточной инженерии заключаются прежде всего в том, что с её помощью возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными микроорганизмами.

Для обмена фрагментами хромосом необходимо предварительно получить из их клеток лишённые клеточной стенки протопласты

Слайд 5. протопласты – это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, обладающие внутриклеточными органеллами и характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии);

Итак, первый этап работы связан с удалением клеточной стенки.

Слайд 6. Для получения протопластов растительных клеток применяют механический способ освобождения от клеточной стенки. Тонкая полоска ткани растения выдерживается сначала в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласт не "сожмется" и не отойдет от клеточных стенок, затем бритвой делается разрез полоски и протопласты высвобождались в среду. Подобные методы имеют определенные ограничения.

Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов.

Слайд 7. Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов – целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность.

У прокариот – эубактерий и актиномицетов – клеточная стенка состоит из жесткого полимера пептидогликана. Пептидогликан может быть расщеплен с помощью ферментов (гидролаз), из которых самым известным является лизоцим. Источником лизоцима как лабораторного реагента является белок куриного яйца.

Если биообъект принадлежит к микроскопическим грибам (плесневым или дрожжевым), то для получения протопластов использую, как правило, не лизоцим, а комплексный ферментный препарат, выделенный из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia. Связано это с тем, что состав клеточной стенки более сложен, чем у бактерии (хитин, глюканы, маннопротеин).

Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время. Ферменты, естественно, должны быть стерильными.

Деградация клеточной стенки в обычных условиях сразу же ведет к лизису клетки из-за разницы в осмотическом давлении. Поэтому для получения протопластов клеточную стенку удаляют ферментативной обработкой в гипертонической среде с 20 % раствором сахарозы или маннита, иногда с 10% раствором натрия хлорида. Также должен поддерживаться оптимальный температурный режим и освещение.

Второй этап состоит в объединении суспензий двух образцов протопластов, принадлежащих разным штаммам или разным видам, в более редких случаях – даже разным родам. Частота слияния резко повышается при добавлении к протопластам полиэтиленгликоля, обладающего свойствами детергента. При всех методах происходит агрегация протопластов, т.к. изменяется их поверхностный потенциал. Затем изменяются структуры мембран, увеличивается их текучесть. Слияние мембран осуществляется в местах, свободных от внутримембранных образований (частиц).

Возможно также слияние, индуцируемое электрическими импульсами, происходит диэлектрическое разрушение соприкасающихся мембран протопластов. Вокруг возникающей "дырки" возможен обмен молекулами липидов с образованием липидных мостиков, что, в конечном счете, приводит к слиянию мембран, поскольку развивается энергетически более выгодное состояние, нежели наличие двух поврежденных мембран.

Слайд 7. Рис.: А – свежеизолированные протопласты после ферментативной обработки;

В – протопласты до слияния и в угловой рамке – сам процесс слияния;

С-Е – результат после слияния:

С – изображен образовавшийся гетерокарион (протопласт с 2 ядрами);

D – представлены 3 гетерокариона, один из которых восстановил клеточную стенку и приступил к процессу митоза;

При этом части диплоидные формы часто переходит в гаплоидные; в результате образуются нормальные способные к размножению клетки с клеточной стенкой. Однако во время нахождения протопластов в диплоидной форме в некоторых из них происходит ломка и воссоединение хромосомных нитей, при котором в одну хромосому может включиться фрагмент другой. Таким образом, при регенерации протопластов формируются нормальные клетки, часть которых имеет гибридные хромосомы. Культуры таких клеток обладают новыми свойствами.

Слайд 8. Очень важной проблемой клеточной инженерии является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа.

Слайд 9. Е – 10-ти дневная культура клеток-производных гетерокарион после деления.

Слайд 10. Для культивирования протопластов используются два методических приема: инкубирование в каплях жидкой среды и помещение в агаровый слой. Естественно, что каждый из них имеет свои преимущества и свои недостатки. В первом случае обеспечивается хороший обмен газами через воздушную фазу и легкая диффузия в раствор выделяемых продуктов обмена. Помимо этого, к растущим протопластам можно легко добавлять свежую питательную среду в желаемых концентрациях. Однако при этом способе протопласты имеют тенденцию агрегировать в центре капли, что препятствует наблюдению за судьбой индивидуальных колоний протопластов. В соответствии со вторым методом определенный объем взвеси протопластов в жидкой среде добавляется к равному объему 1%-ной расплавленной и охлажденной агаризованной среды того же состава. После уплотнения (затвердевания) среды протопласты оказываются разобщенными друг от друга и фиксированными в одном положении, что обеспечивает наблюдение за развитием индивидуальных протопластов. Недостатком метода является возможность механического повреждения протопластов при смешивании с агаром, а также температурные воздействия расплавленной среды при ее недостаточном охлаждении. Само собой разумеется, что существуют различные модификации совершенствования описанных методов. Удобным методом является культивирование протопластов в малом объеме жидкой питательной среды (до 1 мкл), метод получил название микроизоляции отдельных протопластов.

После протопластирования выявляются «плюс»- и «минус»-варианты продуцента по сравнению с производительностью исходной культуры. Отбор «плюс»-вариантов затруднений не вызывает, однако добиться их длительного использования в производстве далеко не просто. После нескольких пересевов их производительность, постепенно снижаясь, приближается к производительности исходной культуры. Для замедления данного процесса предлагается два варианта.

Первый – обработка «плюс»-вариантов мутагенами и отбор мутантов с пониженной способностью к возвращению измененных участков ДНК к норме. Второй связан с возможностью использования инженерной энзимологии – иммобилизованных биообъектов.

Протопласты – основной объект, которым оперирует клеточная инженерия довольно широко используется и в генетической инженерии.