2006_-Byelorussian_Pharmacopoeia_Volume_1

по использованию альтернативного метода взамен фармакопейного теста приве-

дено в разделе «Общие положения»:

«Описанные испытания и методики количественного определения являются

официальными методами, на которых основаны стандарты Фармакопеи. По со-

глашению с компетентными органами в целях контроля могут использоваться

альтернативные методы анализа, при условии, что используемые методы позво- ляют сделать определенное заключение о том, может ли быть достигнуто согла- сие со стандартами статей, если бы были использованы официальные методы. В

сомнительных и спорных случаях единственными надежными методами считают

методы, приведенные в Фармакопее».

Для валидации метода испытания на бактериальные эндотоксины, отличного

от подразумеваемого или указанного в частной статье, предлагаются следующие процедуры.

13.1.Процедура, материалы и реагенты, используемые при проведении испыта- ния с применением лизата амебоцитов, должны пройти валидацию в соответ-

ствии с указаниями, приведенными в испытании на бактериальные эндотокси- ны.

13.2.Должно быть проведено испытание на наличие мешающих факторов (и, при

необходимости, процедура по их исключению) на образцах, отобранных, по

меньшей мере, из трех партий продукции. Следует иметь в виду, что в мето-

дах D и Е, использующих хромогенный пептид, требуются реагенты, не ис- пользуемые в методах А, В, С и F, и поэтому соответствие методов А, В, С и F

требованиям, предъявляемым к мешающим факторам, не может быть без со-

ответствующего подтверждения экстраполировано на методы D и Е.

14.ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ ДЛЯ НОВЫХ ПРОДУКТОВ

Процедуры, описанные в пунктах 13.1 и 13.2, должны быть выполнены для всех новых продуктов, предназначенных для парентерального применения, кото- рые, в соответствии с требованиями Фармакопеи, должны быть подвергнуты ис- пытанию на наличие бактериальных эндотоксинов.

2.6.15. АКТИВАТОР ПРЕКАЛЛИКРЕИНА

Активатор прекалликреина (АПК) активирует прекалликреин, переводя его в

калликреин, и может быть определен по его способности к отщеплению хромофо-

ра от синтетического пептидного субстрата в условиях, позволяющих определять скорость распада спектрофотометрическим методом; концентрация АПК вычис-

ляется путем сравнения со стандартным препаратом, калиброванным в Междуна- родных Единицах.

За Международную Единицу принята активность установленного количест- ва Международного Стандарта, представляющего собой лиофильно высушенный активатор прекалликреина. Эквивалентность Международного Стандарта в Меж- дународных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохране-

ния.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУБСТРАТА ПРЕКАЛЛИКРЕИНА

Для предотвращения активации коагуляции кровь или плазма, используе-

мая для приготовления прекалликреина, должна контактировать только с пла- стиком или стеклянными поверхностями, обработанными силиконом.

9 объемов человеческой крови приливают к 1 объему антикоагулянтного раствора (ACD, CPD или раствора цитрата натрия R концентрацией 38 г/л), к

которому добавлен гексадиметрина бромид R в количестве 1 мг/мл. Смесь цен- трифугируют при 3600 g в течение 5 минут. Отделяют плазму и снова центрифу- гируют при 6000 g в течение 20 минут для осаждения тромбоцитов. Плазму с

уменьшенным содержанием тромбоцитов отделяют и подвергают диализу против

10 объемов буфера А в течение 20 часов. Диализированную плазму наносят на хроматографическую колонку, содержащую агарозу-DEAE для ионообменной

хроматографии R, уравновешенную с помощью буфера А, в количестве, равном двойному объему плазмы. Колонку элюируют буфером А со скоростью 20

мл/см2/ч. Собирают фракции элюата, регистрируя оптическую плотность при 280 нм (2.2.25). Фракции, содержащие первый пик белка, объединяют таким образом,

чтобы объем объединенных фракций составлял 120% объема плазмы с понижен- ным содержанием тромбоцитов.

Проверяют отсутствие калликреиновой активности в объединенном раство- ре субстрата, смешивая его в соотношении 1:20 с предварительно подогретым раствором хромогенного субстрата, который будет использоваться в определе-

нии, и инкубируют при 370С в течение 2 минут. Субстрат может быть использован в испытании, если увеличение оптической плотности составляет менее 0,001 еди-

ницы в минуту. К собранному раствору добавляют натрия хлорид R в количестве

7 г/л и фильтруют через мембранный фильтр (пористость 0,45 мкм). Порции суб- страта замораживают и хранят при температуре -250С; субстрат перед хранением может быть подвергнут высушиванию из замороженного состояния.

Все процедуры от начала хроматографии до заморозки порций субстрата выполняют в течение одного рабочего дня.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Определение предпочтительно выполнять с использованием автоматиче- ского анализатора ферментов при температуре 370С, используя такие объемы,

концентрации субстратов и времена инкубации, чтобы скорость реакции находи-

лась в линейной зависимости, по крайней мере, до концентрации 35 МЕ/мл. Стан- дарты, образцы и субстрат прекалликреина могут быть при необходимости раз- бавлены буфером В.

Разбавленные стандарты или образцы инкубируют с субстратом прекал- ликреина в течение 10 минут так, чтобы объем неразбавленного образца не пре-

вышал 1/10 общего объема инкубируемой смеси, во избежание ошибок, связан- ных с изменением ионной силы и показателя рН инкубируемой смеси. Смесь или

ее часть инкубируют не менее, чем с равным объемом раствора подходящего синтетического хромогенного субстрата с установленной специфичностью к кал-

ликреину (например, N-бензоил-L-пролил-L-фенилаланил-L-аргинина 4- нитроанилида ацетата R или D-пролил-L-фенилаланил-L-аргинина 4-

нитроанилида дигидрохлорида R), растворенного в буфере В. Регистрируют ско-

рость изменения оптической плотности в минуту в течение промежутка времени от 2 до 10 минут при длине волны, специфичной для используемого субстрата.

Для каждой смеси образца или стандарта готовят контроль, в котором вместо субстрата прекалликреина содержится буфер В.

Вносят поправки в значение А/мин, вычитая результат, полученный для

соответствующего контроля. Строят калибровочную кривую, используя значения, полученные таким образом для препарата сравнения в соответствующих концен-

трациях; используют полученную кривую для определения активности АПК в ис- пытуемом препарате.

Растворяют ингредиенты в воде R, доводят значение рН до 8,0 с помощью

2М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл водой R.

Растворяют ингредиенты в воде R, доводят значение рН до 8,0 с помощью

2М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл водой R.

2.6.16. ИСПЫТАНИЯ НА ПОСТОРОННИЕ АГЕНТЫ В ВИРУСНЫХ ВАКЦИНАХ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Если для проведения испытания требуется предварительная нейтрализа-

ция вируса, используют специфические антитела, не происходящие от человека

или обезьян; если выращивание вируса производилось на тканях птичьего проис- хождения, то антитела не должны, кроме того, происходить от птиц. Для приго- товления антисыворотки используют иммунизирующий антиген, произведенный клеточной культурой, имеющей происхождение, отличное от происхождения вак-

цины, и не содержащей посторонних агентов. Если предписано использование

яиц SPF, яйца отбирают из групп, не содержащих указанные патогены (5.2.2).

ВИРУСНЫЙ ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ

Образцы вирусного посевного материала отбирают во время его сбора и,

если их не подвергают испытанию немедленно, хранят при температуре ниже -

400С.

Половозрелые мыши. Каждой из не менее 10 половозрелых мышей мас- сой от 15 до 20 г вводят интрацеребрально 0,03 мл и внутрибрюшинно 0,5 мл ви-

русного посевного материала. Мышей наблюдают в течение не менее 21 дня.

Производят вскрытие всех мышей, погибших или имеющих симптомы заболева- ния по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их на наличие призна-

ков вирусной инфекции как путем прямого макроскопического осмотра, так и пе- репрививкой подходящих суспензий тканей интрацеребральным и внутрибрюшин-

ным методами дополнительно не менее, чем пяти мышам, которых наблюдают в течение 21 дня. Вирусный посевной материал выдерживает испытание, если ни

одна мышь не обнаруживает симптомов инфекции, которая может быть вызвана

посевным материалом. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% привитых мышей выживают в течение периода наблюдения.

Новорожденные мыши. Каждой из не менее 20 мышей возрастом менее

24 часов вводят интрацеребрально 0,01 мл и внутрибрюшинно не менее 0,1 мл

вирусного посевного материала. Мышей наблюдают ежедневно в течение не ме- нее 14 дней. Производят вскрытие всех мышей, погибших или имеющих симптомы заболевания по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их на нали- чие признаков вирусной инфекции как путем прямого макроскопического осмотра,

так и перепрививкой подходящих суспензий тканей интрацеребральным и внутри- брюшинным методами дополнительно не менее, чем пяти новорожденным мы-

шам, которых наблюдают ежедневно в течение 14 дней. Вирусный посевной ма- териал выдерживает испытание, если ни одна мышь не обнаруживает симптомов

инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты испы- тания считают достоверными, если не менее 80% привитых мышей выживают в

течение периода наблюдения.

Морские свинки. Каждой из не менее 5 морских свинок массой от 350 до

450 г вводят внутрибрюшинно 5,0 мл вирусного посевного материала. Животных наблюдают в течение не менее 42 дней, отмечая наличие симптомов заболева- ния. Производят вскрытие всех морских свинок, погибших или имеющих симптомы

заболевания по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их макроско- пически; ткани исследуют как микроскопически, так и культурально, отмечая нали-

чие признаков инфекции. Животных, выживших в течение периода наблюдения,

умерщвляют и исследуют аналогичным образом. Вирусный посевной материал выдерживает испытание, если ни одна морская свинка не обнаруживает призна- ков инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% морских свинок выживают в течение периода наблюдения.

ВИРУСНЫЙ ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ И ВИРУСНЫЕ СБОРЫ

Образцы отбирают во время сбора и, если их не подвергают испытанию немедленно, хранят при температуре ниже -400С.

Бактериальная и грибковая стерильность. Образец объемом 10 мл дол-

жен выдерживать испытание на стерильность (2.6.1).

Микоплазмы. Образец объемом 10 мл должен выдерживать испытание на микоплазмы (2.6.7).

Микобактерии (2.6.2). Образец объемом 5 мл подвергают испытания на

наличие Mycobacterium spp. методами культивирования, обладающими известной

чувствительностью в отношении определения этих организмов.

Испытание клеточной культуры на другие посторонние агенты. Ней-

трализованные образцы, эквивалентные 500 человеческим дозам, но не менее 50 мл, если иные количества не предписаны в частной статье, испытывают на при-

сутствие посторонних агентов путем введения в непрерывные почечные обезья-

ньи и человеческие клеточные культуры. Если вирус выращен на человеческих диплоидных клетках, нейтрализованный вирусный сбор также испытывают на от- дельной культуре диплоидных клеток. Если вирус вакцины выращен не на чело- веческой либо обезьяньей клеточной системе, то производят также инокуляцию

клеток данного вида из отдельной партии. Клетки инкубируют при температуре

36±10С и наблюдают в течение 14 дней. Вирусный посевной материал или сбор

выдерживает испытание, если ни в одной из клеточных культур не обнаруживает- ся признаков любых посторонних агентов, не внесенных в результате случайной

контаминации. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% клеточных культур остаются жизнеспособными.

Птичьи вирусы (требуется только для вирусов, выращенных на тканях птичьего происхождения). Нейтрализуют образец, эквивалентный 100 челове- ческим дозам, но не менее 10 мл. Используя по 0,5 мл на каждое яйцо, инокули-

руют группу оплодотворенных яиц SPF возрастом от 9 до 11 дней аллантоисным путем, а другую группу, возрастом от 5 до 7 дней, - в желточный мешок. Инкуби- руют в течение 7 дней. Вирусный посевной материал или сбор выдерживает ис-

пытание, если в аллантоисных жидкостях и жидкостях желточных мешков не об- наруживаются гемагглютинирующие агенты и если ни один из эмбрионов и хорио-

аллантоисных мембран не обнаруживает макроскопической патологии. Результа- ты испытания считают достоверными, если не менее 80% привитых яиц выживают в течение 7 дней.

ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА: КОНТРОЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Контрольные клетки изучают под микроскопом на отсутствие любой цитопа- тической дегенерации вирусного происхождения. Изучение проводят в течение

периода инкубации, но не менее, чем в течение 14 дней после инокуляции. Ре-

зультаты испытания считают достоверными, если не менее 80% контрольных кле- точных культур выживают в течение периода наблюдения.

В момент последнего сбора вирусов, но не ранее, чем на 14-й день, выпол- няют нижеописанные испытания.

Испытание на гемадсорбирующие вирусы. Не менее 25% контрольных

культур испытывают на наличие гемадсорбирующих вирусов путем добавления

эритроцитов морских свинок. При необходимости, эритроциты морских свинок

можно хранить при температуре 5±30С в течение не более 7 дней. Состояние по- ловины культур оценивают после инкубации при температуре 5±30С в течение 30 минут, а состояние другой половины – после инкубации при температуре от 20 до 250С в течение 30 минут. Признаков присутствия гемадсорбирующих агентов не должно обнаруживаться.

Испытание клеточных культур на другие посторонние агенты. Собира-

ют супернатанты контрольных клеток и испытывают на присутствие посторонних агентов путем введения в почечные обезьяньи и человеческие клеточные культу- ры. Если вирус вакцины выращен не на человеческой или обезьяньей клеточной

системе, то производят также инокуляцию клеток данного вида, но из отдельной партии. На каждой клеточной системе испытывают не менее 5 мл. Инокулирован- ные культуры инкубируют при температуре 36±10С и наблюдают в течение 14 дней. Признаков присутствия посторонних агентов не должно обнаруживаться.

Если производственная клеточная культура поддерживается при темпера- туре, отличной от 36±10С, выполняют дополнительное испытание на посторонние

агенты при этой температуре с использованием клеток того же типа, который ис-

пользуется для выращивания вируса.

КОНТРОЛЬНЫЕ ЯЙЦА

Гемагглютинирующие агенты. По 0,25 мл аллантоисной жидкости каждого

из яиц испытывают на гемагглютинирующие агенты путем непосредственного смешивания с куриными красными кровяными тельцами и после засева яиц SPF,

выполняемого следующим образом: инокулируют объединенный образец амнио-

тических жидкостей общим объемом 5 мл в аллантоисную и амниотическую по- лости яиц SPF. Объемы введения – по 0,5 мл. Контрольные яйца выдерживают

испытание, если ни в одном случае не обнаруживаются признаки присутствия ге- магглютинирующих агентов.

Вирусы птичьего лейкоза. Используют образец объединенных амниоти-

ческих жидкостей контрольных яиц общим объемом 10 мл. Проводят усиление пу- тем пяти пассажей на клеточных культурах куриных эмбрионов, не содержащих вирусов лейкоза; испытание на птичий лейкоз выполняют с использованием кле-

ток, полученных в пятом пассаже. Контрольные яйца выдерживают испытание, если не обнаруживается признаков присутствия вирусов лейкоза.

Другие посторонние агенты. Образцы объединенных амниотических жид- костей контрольных яиц по 5 мл прививают на человеческие и обезьяньи клеточ-

ные культуры. Клеточные культуры наблюдают в течение 14 дней. Контрольные яйца выдерживают испытание, если не обнаруживается признаков присутствия

посторонних агентов. Результаты испытания считают достоверными, если не ме- нее 80% привитых культур выживают до окончания периода наблюдения.

2.6.17. ИСПЫТАНИЕ НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА

Для определения антикомплементарной активности (АКА) иммуноглобулина

определенное количество испытуемого материала (10 мг иммуноглобулина) под- вергают инкубации с определенным количеством комплемента морских свинок (20

СН50), после чего титруют остаток комплемента; антикомплементарная активность

выражается как поглощение комплемента, в процентах к контрольному образцу комплемента, принимаемому за 100%.

За гемолитическую единицу активности комплемента (СН50) принимают та- кое его количество, которое в данных реакционных условиях приводит к лизису 2,5×108 из общего количества 5×108 оптимальным образом сенсибилизированных эритроцитов.

Основной раствор магния и кальция. 1,103 г хлорида кальция R и 5,083 г

хлорида магния R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворите-

лем.

Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г хлорида натрия R и 25,48

г барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение рН до 7,3 1М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного рас-

твора кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мем-

бранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 40С в стеклянных контейне- рах.

Раствор желатина. 12,5 г желатина растворяют приблизительно в 800 мл воды R и нагревают на водяной бане до кипения. Охлаждают до 200С и разбавля-

ют до 10 л водой R. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм).

Хранят при 40С. Использованию подлежат только прозрачные растворы.

Раствор цитрата. 8,0 г цитрата натрия R, 4,2 г хлорида натрия R и 20,5

г глюкозы R растворяют в 750 мл воды R. Доводят значение рН до 6,1 раствором лимонной кислоты R концентрацией 100 г/л и разбавляют водой R до 1000 мл.

Буферный раствор желатина и барбитала. 4 объема раствора желатина

добавляют к 1 объему основного буферного раствора барбитала и перемешива- ют. При необходимости доводят значение рН до 7,3, используя 1 М раствор гид-

роксида натрия или 1 М хлористоводородную кислоту. Хранят при 40С. Еже-

дневно готовят свежие растворы.

Стабилизированная овечья кровь. Смешивают равные объемы овечьей крови и раствора цитрата и перемешивают. Хранят при 40С не менее 7 и не более 28 дней. (Стабилизированная овечья кровь и эритроциты овцы доступны в раз- личных коммерческих источниках).

Гемолизин. Антисыворотку против красных кровяных телец овцы готовят с использованием кроликов. (Такие антисыворотки доступны в различных коммер-

ческих источниках).

Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10

морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугировани- ем при температуре около 40С. Сыворотку хранят в небольших количествах при

температуре ниже -700.

МЕТОД

Приготовление стандартизированной 5% суспензии эритроцитов ов-

цы. Эритроциты овцы отделяют центрифугированием соответствующего объема

стабилизированной овечьей крови, промывают не менее трех раз буферным рас-

твором желатина и барбитала и готовят в том же растворе суспензию с содержа- нием клеток 5 объемных процентов. Плотность клеток в суспензии определяют

следующим образом: 0,2 мл добавляют к 2,8 мл воды R и центрифугируют лизи-

рованный раствор 5 минут при 1000 g; плотность клеток соответствует требовани- ям, если оптическая плотность (2.2.25) супернатанта при 541 нм составляет 0,62±0,01. Плотность клеток корректируют добавлением буферного раствора же-

латина и барбитала в соответствии с формулой:

А- оптическая плотность исходной суспензии при 541 нм.

Суспензия после коррекции содержит около 1´109 клеток в миллилитре.

Титрование гемолизина

Готовят разведения гемолизина в соответствии с Таблицей 2.6.17.-1.

*1,0 мл смеси отбрасывают

К каждой пробирке из серии разведении гемолизина, начиная с разведения

1:75, добавляют по 1,0 мл 5% суспензии эритроцитов овцы и перемешивают. Ин- кубируют при 370С в течение 30 минут.

По 0,2 мл каждой из этих инкубированных смесей переносят в новые про- бирки и добавляют по 1,10 мл буферного раствора желатина и барбитала и по 0,2 мл разбавленного комплемента морских свинок (например, в разведении 1:150). Эти операции выполняют дважды.

Вкачестве контрольного образца негемолизированных клеток готовят три пробирки, содержащие по 1,4 мл буферного раствора желатина и барбитала и 0,1

мл 5% суспензии эритроцитов овцы.

Вкачестве полностью гемолизированного контрольного образца готовят три пробирки, содержащие по 1,4 мл воды R и 0,1 мл 5% суспензии эритроцитов овцы.

Все пробирки инкубируют при 370С в течение 60 минут и центрифугируют 5

минут при 1000 g. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) супернатантов при 541 нм и вычисляют для каждой из пробирок степень гемолиза, в процентах, по фор- муле:

На миллиметровой бумаге строят график зависимости степени гемолиза в процентах (по оси ординат) от обратного значения соответствующего разведения

гемолизина (по оси абсцисс). Определяют из графика оптимальное разведение гемолизина. Выбирают разведение таким образом, чтобы дальнейшее увеличе-

ние количества гемолизина не приводило бы к существенному изменению степени гемолиза. Это разведение принимают за одну минимальную гемолитическую еди- ницу (1 МГЕ) в 1,0 мл. Оптимальное гемолитическое разведение гемолизина для приготовления сенсибилизированных эритроцитов овцы составляет 2 МГЕ/мл.

Результат титрования гемолизина считают достоверным при условии, что

максимальная степень гемолиза составляет от 50 до 70%. Если максимальная степень гемолиза не находится в этих пределах, титрование повторяют с исполь-

зованием более или менее разбавленного раствора комплемента.

Приготовление оптимизированных сенсибилизированных эритроцитов (гемолитической системы).

Готовят подходящий объем разбавленного гемолизина с содержанием 2 МГЕ/мл и равный объем стандартизированной 5% суспензии эритроцитов овцы.

Добавляют разведение гемолизина к стандартизированной суспензии клеток и пе- ремешивают. Инкубируют при 370С в течение 15 минут, после чего хранят при

температуре от 20С до 80С и используют в течение 6 часов.

Титрование комплемента

Готовят подходящее разведение комплемента (например, 1:250) с исполь-

зованием буферного раствора желатина и барбитала и выполняют титрование в двух повторностях в соответствии с Таблицей 2.6.17.-2.

К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,2 мл сенсибилизирован-

ных эритроцитов овцы, хорошо перемешивают и инкубируют при 370С в течение

60 минут. Пробирки охлаждают на ледяной бане и центрифугируют 5 минут при 1000 g. Измеряют оптическую плотность супернатанта при 541 нм и вычисляют

степень гемолиза (Y) по формуле:

Ac − A1 , Ab − A1

где :

На миллиметровой бумаге с логарифмическим масштабом по обеим осям

строят график со значениями Y/(1-Y) на оси абсцисс и количеством разведенного комплемента на оси ординат. Строят наилучшую прямую, соответствующую нане- сенным точкам и определяют ординату для дозы комплемента, приводящей к 50% гемолизу, т.е. Y/(1-Y) = 1,0. Вычисляют активность, в гемолитических единицах

(СН50/мл) по формуле:

5- масштабный множитель для учета количества эритроцитов.

Испытание на антикомплементарную активность

Готовят разведение комплемента, содержащее 100 СН50/мл, путем разбав-

ления титрованного комплемента морских свинок буферным раствором желатина и барбитала. При необходимости, доводят значение рН испытуемого иммуногло- булина до 7. Для иммуноглобулина с содержанием 50 мг/мл готовят следующие смеси для инкубации:

Проводят испытание испытуемого образца иммуноглобулина и готовят по- ложительный и отрицательный контроли АКА с использованием стандартного об-

разца человеческого иммуноглобулина BRP, в соответствии с указаниями на ли-

стке-вкладыше, сопровождающем стандартный препарат. Если концентрация им- муноглобулина отличается от 50 мг/мл, используют большие либо меньшие объ-

емы образца и буферного раствора желатина и барбитала; например, при концен- трации иммуноглобулина 30 мг/мл, к 0,33 мл его раствора добавляют 0,47 мл бу- ферного раствора желатина и барбитала с получением 0,8 мл. Пробирки укупори- вают и инкубируют при 370С в течение 60 минут. По 0,2 мл каждой из инкубиро- ванных смесей добавляют к 9,8 мл буферного раствора желатина и барбитала для разбавления комплемента. Вышеописанную операцию титрования компле-

мента проводят для каждой из пробирок, определяя остаточную активность ком-