Изменение рН мало влияет на спектры поглощения изолированных пептидных хромофоров.
В противоположность этому тирозин и триптофан весьма
чувствительны к рН.
Спектрофотометрическое
титрование панкреатической РНКазы быка (содержит 6 тирозиновых остатков).
А. Изменение спектра поглощения с изменением рН и со временем (при рН 12,2). При меньших значениях рН зависимость от времени отсутствует. Б. Зависимость коэффициента экстинкции при 295 нм от рН.
А |
Б |
Многие белки содержат группы, отличающиеся от обычных аминокислот.
ПРИМЕРЫ
ГЕМПРОТЕИНЫ
РОДОПСИН
ФЛАВОПРОТЕИНЫ
Очищенный родопсин был измерен дважды: сначала он был выделен из адаптированной к темноте коровьей сетчатки (сплошная кривая) и затем снова выделен из сетчатки после ее освещения (пунктирная
кривая). (From M.L. Applebury, DM. Zuckerman, A.A. Lamola, and T.M. Jovin, 1974, Biochemistry 13 : 3448. Copyright by the American Chemical Society
Спектр поглощения коровьего родопсина в УФ и видимой областях.
Зеленый
хлорофилл
Спектры поглощения некоторых
хромофорных белков
Оранжевый каротин
Красный
оксигемоглобин
Спектры поглощения цитохрома с (Fe3+) при различных значениях рН 1.7 – 6.8
Дифференциальный спектр – разностный
спектр, который получается при автоматическом вычитании из спектра поглощения вещества в измеряемой кювете спектра поглощения вещества в кювете сравнения.
D( ) Спектр в кювете сравнения
D( ) Спектр в измеряемой кювете
Дифференциальный спектр:
D( ) D( ) D( )
Если разложить это в степенной ряд по малому параметру и пренебречь членами второго порядка малости, тогда дифференциальный спектр будет D
D( )
В первом приближении дифференциальный спектр
поглощения соответствует первой производной
от спектра поглощения
D
СПЕКТР ПОГЛОЩЕНИЯ ТРИПТОФАНА В ВОДЕ
МАКСИМУМ ПРИ 280 нм И МАЛЕНЬКИЙ ПИК ПРИ 288 нм
СПЕКТР ПОГЛОЩЕНИЯ (а) и ТЕМПЕРАТУРНО-ПЕРТУРБАЦИОННЫЙ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ СПЕКТР (б) ТРИПТОФАНА В ВОДЕ
Градиент температуры 10о, D – дифференциальная оптическая плотность
Для получения ТЕМПЕРАТУРНО-ПЕРТУРБАЦИОННЫХ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫХ СПЕКТРОВ раствор белка одинаковой концентрации помещают в кюветы, в которых создают разность температур.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ СПЕКТР ИМЕЕТ НЕСКОЛЬКО УЗКИХ МАКСИМУМОВ
СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ БЕЛКОВ МАЛО ОТЛИЧАЮТСЯ ДРУГ ОТ ДРУГА, ТОГДА КАК ТЕМПЕРАТУРНО-ПЕРТУРБАЦИОННЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СПЕКТРЫ СУЩЕСТВЕННО РАЗЛИЧНЫ