Взаимодействие веществ с биологической мембраной

В основе механизма взаимодействия веществ с мембраной без непосредственного проникновения молекул внутрь клетки лежит концепция рецепторов. В данном случае рецептор – это расположенная в мембране молекулярная белковая структура, являющаяся центром специфического взаимодействия с находящимся вне клетки веществом. Предположения о существовании участков (рецепторов) избирательного действия веществ были впервые высказаны П. Эрлихом в самом начале ХХ века и сформулированы в виде его известного принципа: «вещества не действуют, если не фиксируются». В 1908 г. за развитие теории рецепторов, ставшей в дальнейшем основой для химиотерапии, П. Эрлих получил Нобелевскую премию.

ПАРАМЕТРЫ И ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТОКСИКОМЕТРИИ

Общая характеристика

Токсикометрия – это комплекс принципов и методов количественной оценки основных параметров токсичности химического вещества. В токсикометрии для характеристики вещества используется его способность вызывать объективно измеряемый и количественно оцениваемый в унифицированных единицах биологический (токсический) эффект. Благодаря этому становится возможным количественно оценить и объективно сравнить токсичности химического вещества с аналогичными или иными биологическими (токсическими) эффектами, отмечаемыми у других веществ.

Одним из основных понятий в токсикометрии является доза вещества, которая выражается в единицах массы вещества, отнесенных к единице массы тела животного или человека – г/кг, мг/кг и т.д. Понятие дозы используется для обозначения того количества вещества, которое действует на биологический объект. Понятие концентрация вещества, в качестве единиц измерения которой используется отношение единиц массы вещества к единицам объема (г/м³, мг/л и т.д.), применяется для характеристики содержания вещества в газообразных или жидких средах. При попадании вещества на кожу и слизистые оболочки доза может быть отнесена к единице поверхности (мг/см²). Сложнее оценить зависимость между концентрацией вещества при ингаляционном воздействии и его дозой в организме животного или человека. Для этого делается допущение, что ингаляционная доза прямопропорциональна концентрации вещества во вдыхаемом воздухе за определенное время. Кроме того, учитывается интенсивность дыхания, которая зависит от состояния и физической нагрузки животного или человека. Таким образом, если человек массой m (кг) вдыхает воздух с концентрацией в ней вещества С (мг/л) в течение t (мин) при интенсивности дыхания V (л/мин), то количество попавшего в организм вещества (мг/кг) будет равно:

.

Немецкий химик Ф. Габер сделав допущение, что для находящихся в одинаковых условиях людей или животных отношение будет постоянно, разделив на него обе части упростил предыдущее выражение получив:

W = Ct,

где W – коэффициент токсичности (мг·мин/л) по Габеру, являющийся постоянной величиной. Это произведение позволят проводить ориентировочное сравнение токсичности веществ при их поступлении в организм ингаляционным путем.

Взаимодействие химического вещества с организмом может быть охарактеризовано регистрируемой различными объективными методами ответной реакцией – биологическим эффектом. Реакция любой достаточно сложной биологической системы, возникающая в ответ на поступление вещества, реализуется, как правило, на всех иерархических уровнях ее организации. Структура такой реакции определяется как дозой, токсичностью и временем действия вещества, так и уровнями организации (от молекулярного до организменного), принимающими участие в реализации ответа и которые могут в различной степени проявлять чувствительность к действию вещества. Реакции на эти воздействия могут привести к заметным биологическим эффектам, которые, однако, остаются в пределах физиологической нормы, укладываясь в способности организма поддерживать гомеостаз. Другие реакции могут выходить за рамки диапазона нормальной компенсации, осуществляемой гомеостазом, и представлять действительную или потенциальную опасность для нормального функционирования организма. Таким образом, наблюдаемый биологический эффект может и не быть сигналом опасности при взаимодействии организма и вещества, однако по мере увеличения дозы (концентрации) и времени воздействия может перерасти в неблагоприятный – токсический.

Количественная оценка заключается в установлении зависимостей между дозой (концентрацией) химического вещества и величиной наблюдаемого эффекта, возникающего в результате воздействия, проявляющегося как отклонение биологического показателя от исходной величины или нормы. В количественном отношении все имеющие важность в данном случае свойства исследуемого на его токсичность вещества (молекулярная масса, растворимость, летучесть и т.д.) представлены практически однозначно. Напротив, все свойства даже одного и того же биологического объекта непрерывно меняются, как во времени, так и в пространстве, и количественно могут быть выражены только в вероятностной форме.

Ограничения, накладываемые на дозу (концентрацию) как ведущий фактор, определяющий характер биологической реакции, приводят к необходимости учитывать в ответе организма на внешние воздействия его чувствительность – индивидуальную или групповую. При этом меньшая доза (концентрация) вызывающая ответную биологическую реакцию соответствует более высокой чувствительности и наоборот. В связи с этим, оценка количественной зависимости ответной реакции (эффекта) наблюдаемой у отдельного индивидуума или группы на воздействие разных доз (концентраций) химических веществ носит аппроксимационный характер и выражается в виде кривых зависимости «доза-эффект».

Основополагающие исследования в области количественной оценки биологического действия химических веществ дают возможность представить несколько характерных видов кривых зависимостей «доза-эффект»:

- линейная, когда зависимость эффекта от дозы (концентрации) выражается прямой линией. Однако, реальная кривая начинается не совсем точно от нулевой дозы (концентрации): вследствие отсутствия измеряемого эффекта ниже определенного порога она смещена вправо по оси абсцисс и возрастает до определенной предельной величины, характеризующей максимальный 100 % биологический эффект.

- зависимость по принципу «все или ничего», когда пороговая и предельная или вызывающая максимальный эффект доза (концентрация) совпадают.

- S-образные кривые, когда малые изменения дозы (концентрации) вызывают значительный эффект, а дальнейшие бóльшие изменения дозы (концентрации) сопровождаются незначительным возрастанием ответной реакции, что представляет трансформацию прямой линии с верхней и нижней асимптотами. Такая форма кривой «доза-эффект» может быть объяснена тем, что каждый индивидуум в группе обладает единственной, свойственной ему «устойчивостью», поэтому нужна определенная доза (концентрация) для развития эффекта. В принципе существует такая низкая доза (концентрация), на которую непосредственной биологической реакцией не отвечает ни один организм в группе, и высокая доза (концентрация), на которую отвечают все без исключения. В большинстве случаев справедливость этого положения подтверждает удовлетворительная аппроксимация зависимости «доза-эффект» кривой характерной для нормального распределения.

Между этими видами расположены другие – гиперболические, экспоненциальные и параболические кривые «доза-эффект», которые отражают не только различия отдельных особей (индивидуумов) в чувствительности к химическому веществу, но также и зависимость между его дозой (концентрацией) в месте его приложения и особенностями взаимодействия с биологическим объектом.

Анализ кривых «доза-эффект» широко применяется при экспериментальной оценке токсического действия различных химических веществ на животных, при этом учитываются следующие основные характеристики:

- центральная точка кривой, соответствующая 50 % эффекту, которая является наиболее точной количественной характеристикой токсичности вещества;

- максимальная часть кривой, соответствующая 100 % эффекту.

Кривая «доза-эффект» является основной графической токсикометрической характеристикой веществ, дающей возможность сравнивать их токсическое действие, а ее более углубленный анализ позволяет получить всю необходимую информацию.

Развитие во времени эффекта действия определенной дозы (концентрации) для биологических объектов описывается кривой «время-эффект», а зависимость между дозой (концентрацией) и временем наступления определенного эффекта – «доза-время». Зависимости «доза-время» используются для количественной оценки биологической активности действующего химического вещества, при этом во внимание принимается время, в течение которого возникшие отклонения возвращается к норме. Несмотря на возможную нелинейность, априорно предполагается, что более интенсивным воздействиям соответствует и большая продолжительность восстановительных процессов.

В реальных условиях на человека или животное, как правило, действует не одно, а несколько химические веществ. В наблюдающимся совместном (сочетанном или комбинированном) действии химических веществ три типа взаимодействия: аддитивное, антагонистическое и синергическое. При аддитивном или независимом типе отсутствует влияние действия одного вещества на другое и возникающая при этом биологическая реакция является суммой эффектов, вызываемых каждым веществом по отдельности. Синергизм или потенцирование при совместном поступлении в организм двух и более веществ характеризуется усилением ответной биологической реакции по сравнению с действием в отдельности каждого вещества. Для антагонизма характерным является ослабление или подавление биологического эффекта при совместном действии веществ по сравнению с влиянием отдельного вещества.

Основные параметры токсикометрии

В токсикометрии используются следующие основные параметры, которые позволяют количественно охарактеризовать токсические свойства химических веществ:

1. Абсолютная смертельная (летальная) концентрация (LС₁₀₀) или доза (LD₁₀₀), вызывающая гибель всех (100 %) животных, взятых в опыт;

2. Среднесмертельная концентрация (LС₅₀) или доза (LD₅₀), вызывающая гибель половины (50 %) взятых в опыт животных;

3. Максимально переносимая концентрация (LС₀) или доза (LD₀), не вызывающая гибель животных в данной группе;

4. Порог острого действия – минимальная концентрация или доза, которая способна вызвать токсический эффект при однократном воздействии (Lim_ас);

5. Порог хронического действия – минимальная концентрация или доза, которая способна вызвать токсический эффект при хроническом воздействии (Lim_ch);

6. Порог специфического действия – минимальная концентрация или доза, которая способна вызвать избирательный (специфический) токсический эффект при воздействии (Lim_sp);

7. Зона острого действия (Z_ас), которая вычисляется как Z_ас = LС₅₀/Lim_ас или Z_ас = LD₅₀/Lim_ас;

8. Зона хронического действия (Z_ch), которая вычисляется как Z_ch = Lim_ас/ Lim_ch;

9. Коэффициент возможного ингаляционного отравления (КВИО), который определяется как отношение насыщающей концентрации вещества при 20 ºС к среднесмертельной концентрации – С²⁰_max /LС₅₀;

10. Коэффициент вариабельности видовой чувствительности (КВЧ), который выражается в виде отношения среднесмертельных концентраций для наиболее устойчивого вида животных к наиболее чувствительному – LС_50max/LС_50min.

Среднесмертельная концентрация (LС₅₀) или доза (LD₅₀) является основным параметром токсичности и позволяет сравнивать различные вещества (табл. 3). Иногда среднесмертельная доза (LD₅₀) обозначается как ЕD₅₀ и называется среднеэффективной дозой. Величина устанавливается на сравнительно не­большом (30-40) количестве животных, носит вероятност­ный характер и рассчитывается с применением статистических методов.

Таблица 3.

Сравнительная токсичность некоторых веществ биологического и небиологического происхождения для белых лабораторных мышей (внутрибрюшинное введение)

Вещество	Источник	LD50, мкг/кг массы
Ботулотоксин	Микроорганизмы	0,0003
Тетанотоксин	Микроорганизмы	0,001
Батрахотоксин	Лягушки	2
Рицин	Растения	3
Тетродотоксин	Рыбы	8
Сакситоксин	Моллюски	9
Бунгаротоксин	Змеи	14
Диоксин	Синтез	200
Курарин	Растения	500
Диизопропилфторфосфат	Синтез	1 000
Иприт	Синтез	8 600
Цианид натрия	Синтез	10 000
Таллия сульфат	Синтез	35 000
Метанол	Синтез	1 000 000

Примечания: диоксин илидиоксины – группа органических веществ, среди которых наибольшей токсичностью обладает 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин; диизопропилфторфосфат (ДФФ) – боевое отравляющее вещество нервно-паралитического действия; иприт - боевое отравляющее вещество кожно-нарывного действия.

При анализе показателей токсических свойств веществ во внимание принимается следующее:

- чем боль­ше различается видовая чувствительность лабораторных животных к воздействию токсического вещества, тем вероятнее, что реакция человека на действие этого вещества может быть аналогичной реакции наиболее чувствительного вида животных;

- чем уже зона острого действия (Z_ас) вещества, тем опаснее оно в отношении возмож­ности возникновения острого отравления, так как даже небольшое повышение концентрации (начиная от поро­говой) уже может вызвать смертельный исход;

- чем выше насыщающая концентрация вещества при комнат­ной температуре и ниже среднесмертельная концентрация (соот­ветственно значение КВИО больше), тем вероятнее возможность развития острого отравления при утечке газа или летучего веще­ства.

Приведенные выше закономерности учитываются в дальнейшем при обосновании величины коэффициента запаса и ПДК.

ГИГИЕНИЧЕСКОЕ РЕГЛАМЕНТИРОВАНИЕ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

В основе гигиенического регламентирования (нормирования) лежит определение предельно допустимых концентраций химических веществ в окружающей среде. В соответствии с ГОСТ 12.005-76 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны – концентрации, которые при ежедневной (кроме выходных дней) работе в течение 8 ч или при другой продолжительности, но не более 41 ч в неделю, в течение всего рабочего стажа не могут вызвать заболеваний или отклонений в состоянии здоровья, обнаруживаемых современными методами исследований в процессе работы или в отдаленные сроки жизни настоящего и последующих поколений». В современных условиях человек может подвергаться неблагоприятному воздействию химических веществ не только в условиях производства, но и в условиях населенных мест (в быту).

В процессе своего совершенствования и развития принципы гигиенического нормирования претерпели значительные изменения. В самом начале – в 1920-30-х гг. – существовало мнение о ненужности установления четких величин ПДК, а следует максимально снижать содержание химических веществ в окружающей среде вплоть до их полного отсутствия. Если следовать этой концепции «нулевых уровней загрязнения», то они реально могут быть достигнуты только в условиях полного запрещения любого вида деятельности человека, которая связана с выбросами или применением химических веществ (производство, транспорт, добыча и переработка нефти, применение лекарств и т.д.). Впоследствии от этой концепции гигиенического нормирования полностью отказались, ввиду ее полной невозможности практической реализации, и была сформулирована концепция пороговости действия опасных и токсичных химических веществ.

Порог вредного действия вещества – это минимальное количество вещества (концентрация или доза), вызывающего функциональные изменения в организме, которые выходят за пределы гомеостатических колебаний и сопровождаются изменениями структуры тканей и органов. Поскольку порогов действия токсического вещества может быть столько же, сколько функциональных систем организма реагирует на поступление вещества, то при гигиеническом нормировании речь идет об установлении «практического порога действия», основанном на целом ряде допущений и являющимся договорной величиной.

Гигиеническое нормирование химических веществ является сложным многоуровневым, проводящимся в определенной последовательности процессом, который подразделяется на следующие этапы:

- предварительное прогнозирование степени опасности и токсичности химических веществ;

- экспериментальное определение величины безопасных уровней воздействия в опытах на лабораторных животных;

- клинико-физиологической и эпидемиологической апробации установленной величины ПДК.

Экспериментальное определение токсичности веществ

Экспериментальное исследования проводят для полной токсикологической оценки химических вещества. В нее входит проведе­ние острых, подострых и хронических экспериментов на животных и изучение отдаленных последствий (канцерогенного, мутагенного, тератогенного и др.) специфического действия веществ.

При постановке острого (однократное воздействие с последую­щим 2-х недельным наблюдением) опыта изучается общий характер действия вещества на организм животного, воздействие его на кожу, слизистую оболоч­ку глаз и верхних дыхательных путей.

Цель подострого (продолжительность до одного месяца) опы­та заключается в выявлении наиболее чувствительных к воздей­ствию токсического вещества органов и систем организма экспе­риментальных животных. Эти сведения важны для правильного выбора адекватных методов и тестов, необходимых при установ­лении порога хронического действия. Кроме того, в подостром эксперименте подробно изучаются кумулятивные свойства веще­ства. Эффект кумуляции выявляется и оценивается по величине коэффициента кумуляции (К_cum).

Основная задача хронического (на протяжении 4-х месяцев) опыта – установление порога хронического общетоксического действия (Lim_ch). Указанная величина служит отправной точкой для установления ПДК..

Устанавливается также порог специфического действия веще­ства (Lim_sp). Специфическим отдаленное вредное действие веще­ства считается лишь в том случае, если оно проявляется на уров­не, находящемся ниже порога хронического общетоксического действия.

Для выявления пороговых концентраций очень важно подо­брать адекватные, высокочувствительные методы исследований, позволяющие судить об изменениях в организме эксперименталь­ных животных. С этой целью в токсикологической практике разработаны различные лабораторные методы исследования.

Основные токсикологические исследования, в зависимости от поставленных задач, проводятся в лабораторных условиях на экспериментальных животных, чаще всего на животных различных ви­дов – мышах, крысах, морских свинках, кроликах, кошках, со­баках. При постановке хронического эксперимента используется не менее двух видов животных (один из них, как правило, крысы).

В условиях лаборатории моделируются те пути поступления в организм человека химических веществ, которые происходят в реальных условиях, причем каждый путь отличается своими особенностями.

Ингаляционный путь поступления вредных химических веществ в организм человека и животных является одним из основных. Для моделирования поступ­ления летучих токсических веществ ингаляционным путем используются затра­вочные камеры различной конструкции. При динамической затравке в камеру вводят воздух, содержа­щий изучаемое вещество, и в течение опыта обеспечивают его непрерывный обмен в камере. Типичная установка для проведения затравки динамическим способом состоящая, как правило, из обеспечивающего движения воздуха компрессора, устройства для подачи исследуемого вещества в камеру, термостата, воздуховодов, реометров, поглотителей и т.п., должна в первую очередь обеспечивать стабильность концентрации нормируемых веществ в зоне дыхания животных.Ингаляционные эксперименты начинаются с «нащупывания» концентраций, лежащих в зоне летального действия, т.е. эффективных концентраций.

Пероральный путьпоступления химических веществ является вторым по значимости после ингаляционного. При этом за­травка животных в хронических экспериментах производится путем поступления токсических веществ в организм с водой или пищей. В острых экспериментах воз­можно введение вещества непосредственно в желудок при помощи зонда. При выборе исходных доз руководствуются теми же положени­ями, что и при выборе концентрации.

Перкутанный путьпоступления химических веществ является следующим по значимости после перорального. Предварительная оценка производится погружением хвостов животных (главным образом мышей) в исследуемое веще­ство. Более детальная количествен­ная оценка перкутанной токсичности производится путем нанесения исследуемой дозы вещества на заранее выстриженный участок кожи животных.

Поступление через слизистую оболочку глазаисследуется внесением в конъюнктивальный мешок глаза кролика исследуемого вещества в количестве нескольких капель.