1.4. Кинетический подход к моделированию переноса заряженных частиц через биологические мембраны

Если необходимо описывать величины трансмембранных токов, обусловленных открытием белковых мембранных каналов, то в этом случае можно при описании самого процесса отталкиваться не от динамики движения ионов или изменения плотности их распределения, а от функционирования самого белка. В само деле, если рассматривать процесс образования комплекса некоторого метаболита с ферментом в его активном центре, то с одной стороны можно проводить довольно подробный и сложный расчет молекулярных взаимодействий, а с другой — ограничится лишь констатацией того факта, что изменение концентрации комплекса фермента с метаболитом убывает пропорционально его концентрации, а возрастает пропорционально произведению концентраций свободных компонент. Во втором случае все особенности процесса включены в величины кинетических констант и, хотя, эти показатели являются весьма интегративными, однако именно они как параметры в ходе аппроксимации экспериментальных кривых наиболее приемлемы.

В самом общем виде процесс действия рецептора может быть описан в виде:

А + Я^АЯ^АЯ*

где А — агонист, Я - пустой рецептор, АЯ — неактивированный рецептор с присоединенным агонистом, АЯ* — активированный рецептор с присоединенным агонистом. Константа равновесия для присоединения агониста имеет вид:

к.. =

'** И] к,,

где ко^ — константа диссоциации, ко_П - константа ассоциации. Константа равновесия для процесса открытия/ закрытия ворот имеет вид:

■ _е=№'\._р

[лд] а

где Р — константа открытия, а - константа закрытия.

С использованием классической теории рецепторов [26] было получено выражение для концентрации агониста, необходимой для получения отклика равного по величине половине максимальной амплитуды, в данных обозначениях имеет вид:

ес₅₀=

⁵⁰ 1+ Е

При этом максимальная доля рецепторов, находящихся в открытом состоянии:

/> =-*-

шах _л , т-,

1+ Е

Экспериментальное изучение механизмов связывания агониста с рецептором и открытия ионного канала производится с использованием двух методик: сайт-специфического мутагенеза и электрофизиологического анализа. Если мутация приводит к изменению значения К_еч, тогда имеет место изменение в структуре связывания агониста с рецептором. Если же изменяется только значение Е, то аминокислотные остатки, затронутые в результате мутагенеза, отвечали за конформационное изменение при открытии/закрытии канала рецептора.

О//

Так, например, свойства глицинового рецептора впервые были изучены на нативных белках из нейронов спинного мозга мыши с использованием кинетических моделей [27]. Были показаны специфические свойства бТуЯ, не

наблюдавшиеся у других представителей семейства LGIC. Так,, например, в отличие от nAChR, открытие канала принципиально невозможно при отсутствии агониста. Также, несмотря на то, что уровень проводимости для канала не является величиной постоянной, он не зависит от концентрации агониста. Функция распределения времени открытия канала имеет, по крайней мере, три экспоненциальные составляющие, отвечающие различным внешним состояниям. Из этого было сделано заключение, что необходимо как минимум три молекулы глицина для достижения максимального отклика при открытии канала. Поскольку структура рецептора до конца не изучена, на данный момент точное количество сайтов связывания глицина неизвестно. Кинетическую модель с тремя состояниями рецептора и тремя сайтами связывания подтверждают многие эксперименты с al-GlyR [28,29]. Однако дальнейшие эксперименты Marco Beato et al показывают возможность наличия пяти состояний рецептора, которую хорошо описывает соответствующая модель (Рис. 1) [30].

5k_+l

4k_+:

3k

•+3

5-4

AR

R

■A

R

fc-i

2k

3k

4k

k

~ A₅R

5k

'-

5

рз A

Рз

P

a,

Од

a.

a.

4

*

КЖ

a₄r

a₅r

J-

3]

k

i-3

R —

AR

j

AoR"

R

3k

-3

Б

P,

AR" A₂R* Ki . _ 2k₊₂

2k₂

fe

Од

Pi

a

AR"

A^R

Рис. 1. Схема взаимных превращений форм белка С1уИ для пяти (А) и трех (Б) сайтов связывания

.В отличие от а1-01уК, процесс активации а2-С1уК может быть с высокой точностью описан кинетической моделью с одним состоянием. Этот рецептор характеризуется очень низким уровнем активации и имеет только одно открытое и одно закрытое состояние [31].

Особое место можно отвести моделям каналов и рецепторов, при описании которых используется вероятностные методы, основанные на прямом или косвенном определении плотности вероятности некоторых биологических молекулярных процессов. Большинство подобных стохастических моделей ионных каналов можно разделить на два типа:

• Модели Маркова

• Модели Ходжкина-Хаксли

Модели первого типа описывают поведение канала, связывая вероятности с состояниями рецептора такими как, например «открытое», «закрытое», «инактивированное». Переходы между состояниями описываются константами скорости, которые зависят от многих физических параметров, таких как температура, мембранный потенциал, концентрации ионов. В моделях типа Ходжкина-Хаксли кинетические свойства каналов описываются коэффициентами, зависящими от времени [32]. Причем влияние коэффициентов на ионный ток через мембраны имеет мультипликативный характер.

Л САГ ')

Моделирование поведения ионных каналов такими методами связано с созданием алгоритмов позволяющих получать значения электрических токов или через одиночный канал или через мембрану [33]. Однако такие модели в

общем случае не учитывают стохастические «шумы», и описывают, поведение канала усреднено.

В простейшем случае Марковская модель может быть представлена в,виде системы дифференциальных уравнений:

где С (7) и 0(7) - вероятности канала находиться в закрытом и открытом состоянии, Vмембранный потенциал, а и»/?(У) - константы,

скорости для переходов между состояниями.

Одним из самых распространенных методов для таких стохастических систем является метод Монте-Карло. Основным его преимуществом является простота построения модели, однако такой метод является* достаточно неудобным в реализации за счет того, что сходимость такого метода

пропорциональна -¿=т,.где N — количество реализаций. Исходя из* этого,

требуется- достаточно большое количество' симуляций для получения» относительно точного результата. Различные расширения метода Монте- Карло, такие как квази-Монте-Карло и» метод Марковских цепей; позволяют несколько увеличить скорость обработки, но не решают эту проблему целиком: Другой методикой позволяющей! оценить влияние констант скорости в конкретной > модели ионного канала является выбор функций плотности вероятности и прямой расчет ионных токов. Среди них достаточно известными являются различные методы теории возмущения и методы вторых моментов. Но, хотя они и являются более эффективными, чем методы Монте-Карло, их достаточно низкая робастность не позволяет рассчитывать даже относительно несложные нелинейные модели.

В целом можно заключить, что при всей привлекательности кинетических подходов (а также связанных с ними подходов стохастических) они в значительной степени упрощают описание процесса формирования трансмембранного тока. Такого рода упрощение может быть приемлемо и даже желательно при описании непосредственных результатов эксперимента, однако подобный подход невольно становится чувствителен к «фитингу кривых». Параметры модели в значительной степени начинают зависеть от стандартности выбранных условий и, в конечном счете, теряют свою информативность. В какой-то степени это снижает и прогностические качества применяемых моделей. Для того что бы избежать вышеописанных сложностей необходимо разработать такой методический подход к описанию движения ионов через поверхности мембран, который сделает возможным представление измеримых макро параметров на основе достаточно четкого моделирования процессов на микроуровне. Изложению именно этого вопроса будет посвящены следующие главы настоящей работы.