Занятие №8

1.ТЕМА. Методы медицинской генетики. Цитогенетический метод. Хромосомные болезни человека.

АКТУАЛЬНОСТЬ: данная тема позволяет раскрыть роль цитогенетического метода в диагностике хромосомных болезней человека, что имеет практическое значение в медицине.

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ

II.1. МЕТОДОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ: изучение хромосомного уровня организации генома важно для понимания механизмов возникновения хромосомной патологии человека как результата нарушения генетического баланса организма.

II.2. УЧЕБНЫЕ ЦЕЛИ:

ЗНАТЬ: понятие кариотипа, строение и функции хромосом, Денверскую номенклатуру хромосом человека, виды геномных и хромосомных мутаций, гаметогенез, мейоз, классификацию хромосомных болезней человека,, клиническую и цитологическую характеристики хромосомных болезней, связанных с гетероплоидией и хромосомными аберрациями аутосом и половых хромосом, понятие хромосомного мозаицизма, основные методы диагностики хромосомных болезней человека. Иметь представление о механизмах геномных мутаций.

УМЕТЬ: различать формы метафазных хромосом (по месту первичной перетяжки, вторичных перетяжек, наличии спутников), группировать хромосомы человека согласно Денверской номенклатуре; по изменению кариотипа устанавливать: диагноз хромосомных болезней, отработать методику изучения Х-полового хроматина в буккальных мазках.

III. Время, выделенное на данное занятие - 1.35 мин.

ОСНАЩЕНИЕ: таблицы: идиограмма нормального кариотипа мужчины и женщины, половой хроматин, диагностика хромосомных болезней, строение и формы хромосом, фотокариограммы Q, R, C, Y дифференциальных окрасок хромосом, наборы метафазных хромосом человека, слайды, микропрепараты: хромосомы человека, Х-половой хроматин.

\/I. НЕКОТОРЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Среди многих методов изучения наследственной патологии человека, цитогенетический метод занимает существенное место. С помощью цитогенетического метода возможен анализ материальных основ наследственности и кариотипа человека норме и патологии, изучение некоторых закономерностей мутационного и эволюционного процессов.

Методы цитогенетического анализа:

1. Изучение ядер, делящихся клеток (кариотипирование):

а) метафазных клеток прямым методом - хромосом в клетках костного мозга;

б) исследование метафазных клеток непрямым методом (культуры клеток периферической крови, кожи, фибробластов и др.). Чаще используется культура лейкоцитов периферической крови. Культивируют лейкоциты, в присутствии фитогемагглюгина, способствующего делению лейкоцитов. Обработав эту культуру клеток колхицином и гипотоническим раствором хлорида натрия, получают хорошо различимые при микрокопировании хромосомные метафазные пластинки, необходимые для кариологического анализа. Препараты окрашивают рутинным методом, используя азуры, основной фуксин, орсеин и др. В настоящее время, применяют специальные методы дифференциального окрашивания хромосом. Основываясь на дифференциальной спирализации хромосом по длине, дифференциальное окрашивание хромосом проводят флюрохромами (Q1 - окраска) и основными нефлюресцирующими красителями (окраска по Романовскому-Гимза) - Y, R, C - окраски, Q - окраска проводится флюрохромами: акрихин, акрихин-иприт, акрихин-пропил, акридиновый оранжевый. В люминисцентный микроскоп видно дифференциальное свечение по длине хромосомы. Рисунок каждой хромосомы специфичен по числу, положению, размерам по-разному светящихся сегментов. С помощью Q-окрашивания хорошо выявляется длинное плечо Y-хромосомы. Y-окраска - число, величина и расположение сегментов в хромосоме аналогичны рисунку при Q-окраске. R-окраска - рисунок противоположен Y-окраске. С-окраска выявляет центромерный и околомерный районы в хромосомах. По локализации выделяют 4 типа С-хроматина:

1. собственно центромерный;

2. гетерохроматин вторичных околоцентромерных перетяжек аутосом 1, 9, 16;

3. гетерохроматин коротких плеч акроцентрических аутосом;

4. гетерохроматин длинного плеча Y-хромосомы.

2. Изучение ядер интерфазных клеток: определение Х-полового хроматина и Y-хроматина (F-тельца) в клетках слизистой оболочки рта, влагалища, волосяной луковицы, в ядрах сегментоядерных лейкоцитов, в сперме. Для экспресс диагностики Х-полового хроматина используют краситель орсеин, Y-полового хроматина - Q1 - окраска.

Для диагностики наследственных болезней плода проводят амнио-центез (на 14-16 неделе беременности). В околоплодных водах клетки плода используют для кариотипирования, определения Х- и Y-полового хроматина, околоплодная жидкость используется для биохимического анализа

\/I. САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Изучить микрофотографии нормального кариотипа мужчины и женщины. Подсчитать число аутосом и гетерохромосом.

2. Изучить демонстрационный препарат хромосомы человека. При увеличении х90 в поле зрения видны лейкоциты, которые имеют округлую форму, компактное округлое темно-окрашенное ядро, окруженное широким ободком светло-голубой цитоплазмы. Среди них найдите хромосомы, лежащие вне клеток в виде скопления - метафазная пластинка. Найдите метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.

3. Провести анализ фотокариограмм человека.

Из фотокариограммы (хромосомы в стадии метафазы) вырезать с помощью глазных ножниц каждую хромосому. Согласно размеру, форме хромосомы подбирают в гомологичные пары. Используя Денверскую номенклатуру, распределите хромосомы по группам. С помощью клея приклейте хромосомы на лист альбома, укажите группу хромосом. Половые хромосомы расположите отдельно.

Определите кариотип. Запишите диагноз в альбомах.

4. Рассмотреть фотокариограмму с дифференцированным свечением метафазных хромосом (Q-окраска).

5. Разобрать схемы и фотокариограммы с дифференциальной Y и R-окраской метафазных хромосом. Обратить внимание на различия размещений линейных полос в хромосомах.

6. Рассмотреть фотокариограмму с дифференциальной С-окраской метафазных хромосом. Обратить внимание на выявляемость сегментов, расположенных в окружности центромерных районов всех хромосом в области вторичных перетяжек 1, 9 и 16 хромосом. К коротких плечах13-15, 21-22 и в длинном плече Y-хромосомы.

7. Микропрепарат Х-половой хроматин в буккальном мазке.

При увеличении х40 видны клетки слизистой ротовой полости. В хорошо окрашенных ядрах около внутренней ядерной оболочки располагается Х-половой хроматин в виде треугольника, зубчика. От других глыбок хроматина он отличается расположением, размером, плотностью.

Зарисуйте несколько клеток, обозначьте цитоплазму, клетки, ядерную оболочку, глыбки хроматина в ядре, половой хроматин.

8. Экспресс-метод исследования Х-полового хроматина в ядрах эпителия слизистой оболочки полости рта.

Перед взятием соскоба, пациента просят обкусать зубами слизистую оболочку щеки и внутреннюю поверхность щеки протереть марлевой салфеткой. Эта процедура необходим для удаления разрушенных клеток, в которых половой хроматин не выявляется. При помощи шпателя или предметного стекла, предварительно обработанного спиртом, проводят легкий соскоб слизистой оболочки щеки. Беловатый налет наносят тонким слоем на обезжиренное предметное стекло. Препарат окрашивают краской ацет-орсеином (уксусная кислота фиксирует клетки, орсеин хорошо окрашивает ядерные структуры), порывают покровным стекло, представляя краске равномерно распределиться по мазку. Большим пальцем придавливают покровное стекло к предметному, предварительно положив на покровное стекло фильтровальную бумагу. Препарат рассматривают под микроскопом ( *90). В поле зрения видны эпиталиальные клетки слизистой оболочки ротовой полости с хорошо окрашенными ядрами..В ядрах половой хроматин располагается около внутренней ядерной оболочки в виде полулуния, зубчика, треугольника. Половой хроматин следует учитывать в клетках с неповрежденным ядром. Подсчет полового хроматина ведут на 100 клеток. В 100 соматических клетках здоровых женщин Х-половой хроматин выявляется в 40-60% ядер.

9.Разбить фотокариограммы аномальных кариотипов, рассмотреть фотографии, слайды больных с геномными нарушениями:

а) трисомия по 13 хромосоме - синдром Патау;

б) трисомия по 18 хромосоме - синдром Эдвардса;

в) трисомия по 21 хромосоме - болезнь Дауна;

г) делеция короткого плеча одной из хромосом 5 пары - синдром «кошачьего писка»;

д) полисомия Х-хромосом у женщин 47, ХХХ, 48, ХХХХ;

е) полисомия Х-хромосом у мужчин - 47, ХХУ, 48, ХХХУ - синдром Клайнфельтера;

ж) полисомия по У-хромосоме - 47 ХУУ, 48, ХУУУ - синдром Клайнфельтера;

з) моносомия по Х-хромосоме - 45, Х0 - синдром Шершевского - Тернера.

IX. ОБРАЗЦЫ ИСХОДНОГО И ИТОГОВОГО КОНТРОЛЯ

ИСХОДНЫЙ КОНТРОЛЬ

Каковы возможности цитогенетического метода?

а) позволяет определять характер наследуемого признака;

б) позволяет прогнозировать проявление признака в потомстве;

в) позволяет подтвердить клинический диагноз наследственного заболевания;

г) позволяет выявить степень зависимости признака от генетических и средовых признаков;

д) позволяет изучить количество и структуру хромосом.

ИТОГОВЫЙ КОНТРОЛЬ

Мужчина высокого роста с женоподобным типом телосложения обратился в консультативную поликлинику с жалобами на отсутствие в семье детей. При экспресс - диагностике х-полового хроматина в соматических клетках обнаружен один половой хроматин. Кариотип 47, ХХУ.

Определите заболевание

ОТВЕТЫ

Исходный контроль: б, в, д.

Итоговый контроль: синдром Клайнфельтера.