лекция4
.pdfТранспозоновый мутагенезез
Транспозон, должен обладать следующимии свойствами:
•высокая частота транспозиции;
•случайная интеграция;
•содержать легко селектируемый ген, напримерример ген устойчивости к антибиотикам;
•широкий круг хозяев
Tn5, Mu
21
Клонирование
Клон – популяция клеток (или молекул), идентичных одной исходной клетке (или молекуле)
Клонирование (cloning) – совокупность процедур, использующихся для получения клонов
Клонирование гена – |
|
Клонирование организма – |
отделение гена от |
|
получение копии данного организма |
других фрагментов ДНК |
|
|
22
Клонирование генов
1.Векторы на основе плазмид, основные требования к вектору
2.Трансформация
3.Создание и скрининг библиотек генов:
1). Выбор источника ДНК для клонирования
2). Создание банка генов
•Конструкция библиотеки кДНК (cDNA library)
•Конструкция геномной библиотеки
3). Скрининг библиотек генов
23
Клонирование генов
1.Векторы на основе плазмид, основные требования к вектору
2.Трансформация
3.Создание и скрининг библиотек генов:
1). Выбор источника ДНК для клонирования
2). Создание банка генов
•Конструкция библиотеки кДНК (cDNA library)
•Конструкция геномной библиотеки
3). Скрининг библиотек генов
24
Свойства вектора на основе бактериальной плазмиды
Требования к вектору:
1. |
Стабильность в клетке-хозяине и в клетках E. coli |
2. |
Репликация в клетках E. coli |
(+ репликация в др.хозяине: ARS – S.cerevisiae; |
|
|
ori SV40 – кл.млекоп.) |
3. Может выдержать вставку чужеродной ДНК
4. Уникальные сайты клонирования
5. Селективный маркер(ы):
устойчивость к антибиотику (E. coli)
+ маркер прототрофности (S.cerevisiae) |
Челночныйый ((shuttle)shuttle) векторвектор |
+ G418 (клетки млекопитающих) |
6. Легкость передачи в клетку-хозяин (трансформация или трансдукция)
25
Введение плазмидной ДНК в клеткитки
Трансформация (бактерии или дрожжи), трансфекция (клетки животных) – наследственные изменения в результате внедрения чужеродной ДНК
Трансформация клеток животных = = злокачественная трансформация
1. Химическая трансформация: |
Компетентные клетки |
|
E.coli |
СaCl – 105 -108 трансформантовов//мкгмкг ДНКДНК |
|
|
2 |
|
|
Другие соли – до 108 трансформантоврмантов//мкгмкг ДНКДНК |
|
S.cerevisiae |
LiCl |
– 103 -105 трансформантовтов//мкгмкг ДНКДНК |
Культура клеток млекопитающих – инкубация с ДНК, осажденнойжденной
фосфатом Ca
26
Введение чужеродной ДНК в клеткитки
2. Электропорация
E.coli 3 х 109 трансформантов/мкг ДНК
S.cerevisiae
Клетки млекопитающих
27
Введение чужеродной ДНК в клеткитки
ДНК
3. Использование липосом
(протопласты бактерий, дрожжей, клетки животных) + липосомы
(«мини-клетки»)
4. Микроинъекция ДНКДНК вв ядроядро
клеток животныхх –– - частота трансформантовформантов 20%20%
5. Слияние протопластовпластов
28
Трансдукция клеток бактерий
Векторы на основе бактериофагов ( , M13)
1)
λ (48,5 kb)
Левая «рука» (Л) |
Правая «рука» (П) |
|
Cos |
Cos |
Cos (cohesive ends) = |
Cos (cohesive ends) = |
|
|
== 1212 bpbp |
2) + фрагмент -> лигирование |
Область, несущественная для |
|
развития фага |
конкатамеры
3) Упаковка in vitro
cos
4) Инфекция E.coli
29