2. Выделение чистой культуры

Отобранные после инкубирования на чашках с полноценным агаром колонии, подвергают рассеву до изолированных колоний на среде того же состава. В том случае, если после инкубирования вырастают изолированные колонии одного типа, проводят микроскопирование одной из них для того, чтобы убедиться, что она представлена морфологически однородными клетками. Для этого применяют простые методы окрашивания или же окрашивание по методу Грама. Часть колонии засевают на поверхность скошенного агара (не менее чем в две пробирки).

Отобранные для идентификации культуры выращивают, засевают в чашки Петри до изолированных колоний или на скошенный агар, сохраняют в холодильнике и в дальнейшем используют для изучения тинкториальных, биологических и физиолого-биохимических свойств по схеме:

3. Изучение биологических свойств бактерий

1. Описание роста исследуемой культуры на плотной и в жидкой питательной среде. При этом учитывается:

- температурный оптимум роста, рост культуры на различных средах, форма колоний,

- размер (диаметр) колоний в мм: если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными,

- поверхность колонии: гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая и т.д.,

- профиль колонии: плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный,

- блеск и прозрачность колонии: блестящая, матовая, тусклая, мучнистая,

- цвет колонии - бесцветная или пигментированная,

- край колонии: ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый,

структура и консистенция колонии: вязкая, тянущаяся, сухая, плотная.

Для описания морфологии колонии может быть использован стереоскопический микроскоп с соответствующим увеличением.

Рост колоний в жидкой среде более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост, отмечают: степень помутнения (слабая, умеренная или сильная); особенности пленки (тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая), а при образовании осадка - указывают плотность, рыхлость, слизистость или хлопьевидность его. Иногда рост в жидкой среде сопровождается появлением запаха, выделением газов, пигментацией. В любом случае, как при росте на плотной, так и в жидкой среде, отмечают возраст описываемой культуры, состав среды и температурный режим культивирования.

2. Анатомические особенности клеток

Окраска бактерий по методу Грама:

- фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор генцианового фиолетового. Окрашивание проводят в течение 1-2 мин,

- бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его в течение 1-2 мин раствором Люголя до почернения,

- сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96° этиловым спиртом (препарат погружают несколько раз в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек с мазка),

- препарат промывают водой;

- мазок дополнительно окрашивают в течение 1-2 мин водным раствором фуксина;

- краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе (можно с помощью фильтровальной бумаги) и микроскопируют с иммерсионной системой;

В результате окрашивания грамотрицательные бактерии - розовые, грамположительные - сине-фиолетовые. При проведении окрашивания по Граму обязательна постановка контролей: окрашивание заведомо грамотрицательных бактерий (Еscherichia.со1i) и грамположительных (Васillus subtilis или Stарhу1ососсиs saprophyticus). При этом необходимо следить, чтобы используемые штаммы были чистыми.

Определение подвижности и окраска бактериальных жгутиков:

микроскопически подвижность определяют у клеток молодой (суточной) культуры. Для того чтобы отличить подвижность от пассивного броуновского движения, к капле исследуемой культуры добавляют каплю 5% водного раствора фенола. Активное движение в этом случае прекращается.

Для определения подвижности можно воспользоваться следующим методом: готовят 0,3 % полноценный агар, разливают его в пробирки по 5-6 мл. Затем тонкой иглой засевают туда исследуемую культуру. Помешают в термостат и после инкубирования в течение 1 -2 суток отмечают характер роста бактерий. Если бактерии подвижны (Еscherichia со1i), то рост их будет наблюдаться по всему столбику агара (диффузное помутнение среды), неподвижные бактерии (Stарhу1ососсиs saprophyticus) растут только по линии укола.

Для окраски жгутиков используют клетки, выращенные на поверхности скошенного агара. Бактериальной петлей отбирают клетки, находящиеся у конденсационной воды и осторожно переносят в стерильную дистиллированную воду, при этом, температура воды должна быть такой же, что и температура инкубирования бактерий на скошенном агаре, а бактерии с петли не стряхивают, а осторожно погружают в воду. Пробирку с бактериями оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Используют химически чистое (вымытое в хромовой смеси) стекло, на которое наносят 2-3 капли суспензии. Суспензию распределяют по поверхности стекла, осторожно его наклоняя. Высушивают на воздухе и на 30 мин заливают красителем Лейфзона. Затем препарат тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Жгутики имеют вид темных прямых образований.

Краситель Лейфзона:

1,5 % раствор хлористого натрия 1,2% раствор основного фуксина, 3 % раствор танниновой кислоты. Все растворы готовят отдельно и смешивают в равных соотношениях только перед употреблением.

Окраска бактериальных спор (по методу Шеффера-Фултона):

- фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги. На него наносят 5-6 капель 5% раствора малахитового зеленого и нагревают 2-3 раза до появления паров, держа стекло над пламенем спиртовки,

- бумажку снимают, препарат промывают водой и в течение 30 сек докрашивают 0,5 % раствором сафранина;

- препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой;

В результате, споры окрашиваются в зеленый цвет (Васillus subtilis), а клетка - в красный.

Определение кислотоустойчивости по методу Циля-Нильсена:

- фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на нее наносят карболовый раствор фуксина, приготовленный по Цилю;

- мазок с красителем 2-3 раза подогревают до появления паров, держа стекло над пламенем спиртовки;

- препарату дают остыть. Снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают водой;

- окрашенный мазок обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (препарат 2-3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней);

- препарат промывают водой и докрашивают в течение 3-5 мин раствором метиленового синего, приготовленного по Леффлеру;

- краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и исследуют с иммерсионной системой. В результате окрашивания кислотоустойчивые бактерии приобретают красный цвет (Mycobacterium rubrum), некислотоустойчивые (Stарhу1ососсиs saprophyticus) - в синий.

Окраска бактериальных капсул (по методу Гинса-Бурри):

- на обезжиренное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной бактериальной петли наносят исследуемые бактерии;

- рядом с первой каплей помещают вторую (каплю туши). Обе капли тщательно смешивают стерильной бактериальной петлей;

- с помощью второго предметного стекла делают мазок, как мазок крови;

- мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. В результате окрашивания на темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов (Azotobacter), окруженные бесцветной капсулой.

Для окрашивания бактериальных капсул, помимо метода Гинса-Бурри, можно воспользоваться методом Антони:

- высушенную на воздухе пленку окрашивают в течение 2 мин 1% раствором кристаллического фиолетового;

- краситель отмывают 20% водным раствором сульфата меди, удаляют его избыток фильтровальной бумагой и подсушивают.

В результате капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы - темно-фиолетовыми.

Окрашивание цитоплазматических включений:

выявление поли--оксимасляной кислоты:

- фиксированные нагреванием бактерии погружают в раствор 0,3% Судана черного В или Судана III (0,1 г Судана в 30 мл 70° этанола). Раствор красителя фильтруют и окрашивают в течение 10-15 мин,

- краситель сливают, препарат высушиваю на воздухе,

- предметное стекло несколько раз промывают в кислоте (толуоле) или заливают ксилолом на 1 мин. Высушивают фильтровальной бумагой,

- дополнительно окрашивают препарат в течение 10-20 сек 0,1 % водным раствором сафранина,

- препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Включения поли--оксимаслянной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет (Pseudomonas fluorescens). Следует обратить внимание, что накоплению поли--оксимасляной кислоты способствует выращивание клеток на средах с соотношением C:N более 10 или же на средах с органическими кислотами.

Окрашивание полифосфатов

- бактериальную культуру фиксируют на предметном стекле нагреванием,

- окрашивают в течение 20-30 сек раствором метиленового синего по Леффлеру,

- отмывают краситель водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Окрашенные гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет .