4. Механизм действия гормонов.

В соответствии с делением гормонов по растворимости на гидрофильные и липофильные различают два механизма передачи сигналов в клетки-мишени:

I. Мембранно-цитозольный, или косвенный.

II. Внутриклеточно-ядерный, или прямой.

I. Мембранно-цитозольный механизм характерен для гидрофильных гормонов и других сигнальных молекул, которые не проникают в клетки и влияют на метаболические процессы в них опосредованно.

В общем виде реализация таких сигналов может быть сведена к трем основным моментам:

1. Взаимодействие гормонов с рецепторами, структурированными в плазматические мембраны клеток-мишеней.

2. Конформационная перестройка специализированных белков – первичных посредников, передающих сигналы от рецепторов белкам-эффекторам.

Роль первичных посредников часто выполняют G-белки. Их так называют, потому что они связаны с гуаниновыми нуклеотидами (от англ. Guanine nucleotides).

3. Активация вторичных посредников (мессенджеров – от англ. messenger – вестник, курьер, рассыльный) – небольших молекул или ионов, диффузия которых в клетке к определенным субклеточным структурам обеспечивает стремительное распространение сигнала гормона и его реализацию каскадными механизмами.

Далее о рецепторах, посредниках, каскадных механизмах подробнее.

Белки-рецепторы относятся к гликопротеинами должна выполнять как минимум две функции:

1. Прием сигнала гормона. Это осуществляет гормонсвязывающий локус (домен).

2. Преобразование принятого сигнала и инициация специфических гормональных эффектов. Это реализует эффекторный локус (домен).

В молекулах белков-рецепторов, локализованных в плазматические мембраны клеток, выделяют три постоянных структурных компонента:

1. Экстрацеллюлярный, находящийся снаружи.

2. Трансмембранный, пронизывающий билипидный слой плазматической мембраны.

3. Интрацеллюлярный, расположенный в цитозоле.

Функции этих элементов у мембранных рецепторов в разных клетках-мишенях у одного и того же гормона могут быть разные. Так α₁-, α₂-, β₁-, β₂-адренорецепторы инициируют в клетках отличающиеся по сути эффекты.

Различают три типа мембранных рецепторов.

1. Рецепторы первого типа представляют из себя интегральные белки с ферментативной активностью. Сигнальные молекулы, связывающиеся с рецептором снаружи, являются аллостерическими модуляторами, изменяющими конформацию всего белка и его ферментативную активность. Последняя обеспечивает фосфорилирование остатка тирозина в белках (рис. 4.1).

Рецепторы инсулина являются тирозинкиназами. Они структурированы в плазматические мембраны клеток-мишеней. Период их полужизни составляет 7 – 12 часов. Они представляют из себя гликогенпротеины (Mr 460 кДа), состоящие из четырех субъединиц, соединенных дисульфидными связями (рис. 4.1). Наружу экспонированы две α-субъединицы (Mr по 135 кДа каждая), а две β-субъединицы (Mr по 95 кДа каждая) пронизывают плазматическую мембрану. Первые выполняют функцию гормон связывающего локуса. Вторые своими участками, выступающими в цитозоль, играют роль тирозинкиназы. Присоединение гормона к рецептору сопровождается фосфорилированием тирозина в соответственных цитоплазматических доменах. При этом одна β-цепь может фосфорилировать другую β-цепь той же молекулы рецептора (аутофосфорилирование). Теперь тирозинкиназа способна фосфорилировать и другие белки-субстраты инсулинового рецептора (англ. Insulin Receptor Substrates - IRS). В любом случае это активирует внутриклеточный сигнальный путь (Ras-путь) и реализацию информации, доставленной сюда инсулином (см. рис. 4.14).

Рис. 4.1. Схема активирования инсулином рецептора первого типа, являющегося тирозинкиназой. 1 – гормон связывающий локус в α-субъединицах; 2 – центр тирозинкиназной активности в β-субъединицах; 3 – субстрат инсулинового рецептора (IRS) неактивный; 4 – субстрат инсулинового рецептора (IRS) активный; 5 – активация внутриклеточного сигнального пути (Ras-пути).

2. Рецепторы второго типа являются олигомерными трансмембранными белками, образующими гормон активирующие ионные каналы. Связывание сигнальных молекул с рецепторами ведет к открыванию каналов для Na⁺, K⁺, Cl^¯ и др. Так «работают» нейромедиаторы, например ацетилхолин через N-холинорецепторы, в которых формируются Na⁺-каналы (рис. 4.2), ГАМК (γ-аминомасляная кислота, γ-аминобутират) через А-рецепторы (Cl^¯-каналы) и др.

Рис. 4.2. Схема рецептора третьего типа на примере N-ацетилхолина.

1 – участки связывания сигнальной молекулы.

2 – сформированный ионный (Na) канал.

3. Интегральные белки, относящиеся к рецепторам третьего типа, участвуют в реализации гормональных сигналов в сочетании с G-белками. Полипептидные цепи этих белков включают по семь трансмембранных тяжей и по три примембранных петли с каждой стороны (рис. 4.3).

Рис. 4.3. Строение гормональных рецепторов третьего типа, сопряженных с G-белками. 1 – олигосахарид; 2 – N-конец; 3 – трансмембранные петли; 4 – С-конец.

Связывание гормона с рецептором третьего типа изменяет конформацию трансмембранных тяжей и примембранных петель. Происходит резкое повышение сродства рецептора к G-белку. Возникает сигнал, передаваемый белками-эффекторами, которые являются либо ферментами (например, аденнилатциклаза, фосфолипаза С), либо ионными каналами. Функция белков-эффекторов заключается в изменении коцентрации вторичных посредников (мессенджеров).

G-белки как первичные посредники передают сигналы от рецепторов третьего типа к белкам-эффекторам (рис. 4.4 А). Они состоят из трех субъединиц: α, β, γ. α-субъединица может связывать гуаниновые нуклеотиды ( англ. Guanine nucleotide): ГТФ или ГДФ. Отсюда их название G-белки. Они образуют семейство, включающее около 20 их разных форм. Но различают два их типа: G_s – стимулирующие (от англ. stimulate) «работают» с рецепторами, передающими стимулирующие сигналы возбуждения (R_s), G_i – ингибирующие белки (от англ. inhibite – ингибировать) передают от R_i сигналы торможения.

В неактивном G-протеине α, β, γ-субъединицы ассоциированы в единую молекулу и к α-субъединице присоединен ГДФ (рис. 4.5 А).

После взаимодействия гормона с рецептором ГДФ замещается на ГТФ (рис. 4.4.Б). Вслед за этим происходит диссоциация G-белка на две части: α-субъединицу в сочетании с ГТФ и комплекс β, γ-субъединиц. α-субъединица-ГТФ активирует белки-эффекторы.

α-субъединица-ГТФ активирует белки-эффекторы (например ферменты аденилатциклазу или фосфорилазу С), что в дальнейшем приводит к накоплению в клетках вторичных посредников (рис. 4.4 В).

α-субъединица проявляет слабую ГТФ-азную активность. Медленно гидролизуя ГТФ до ГДФ, она переводит саму себя в неактивное состояние и вновь ассоциирует с β, γ-комплексом и ГДФ. G-белок возвращается в исходное неактивное состояние. Передача гормонального сигнала прекращается (рис. 4.4 Г), G_s- и G_i-белки, имея одинаковые β- и γ-субъединицы (Mr 40 кДа обеих вместе), включают разные α-субъединицы. В G_s-белке α-субъединица имеет Mr 45 кДа, в G_i – 41 кДа.

Рис. 4.4. Цикл конформационных изменений G-белков в процессе передачи гормонального сигнала. 1 – гормон; 2 – рецептор первого типа; 3 – G-белок; 4 – белок-эффектор (например аденилатциклаза).

Вторичные посредники (мессенджеры) – это внутриклеточные вещества, концентрация которых строго контролируется внеклеточными сигналами, передаваемыми гормонами и другими сигнальными молекулами. Такие вещества образуются из доступных субстратов и имеют короткий период полураспада или являются ионами. Ими являются 3', 5' цАМФ, 3', 5' цГМФ.

1. 3', 5'-циклический аденозинмонофосфат (3', 5' цАМФ);

2. 3', 5'-циклический гуанозин монофосфат (3', 5' цГМФ);

3. Диацилглицерол (ДАГ);

4. Инозитол-1, 4, 5-трифосфат (ИФ₃);

5. Инозитол-1,3, 4, 5-тетрафосфат (ИФ₄);

6. Са²⁺.

Известно несколько путей передачи сигналов с их участием.

1. Аденилатциклазный.

2. Гуанилатциклазный.

3. Фосфоинозитидный.

4. Через «медленные» неэлектрогенные Са²⁺-каналы.

5. Тирозинкиназный.

6. Через «быстрые» электрогенные Na⁺- и другие ионные каналы.

I. Аденилатциклазный путь мембранно-цитозольного механизма. Это самый распространенный путь передачи гормональных сигналов. В его реализации и завершении участвуют, как минимум, шесть белков.

1. Белки-рецепторы третьего типа (рис. 4.3) взаимодействуют с сигнальными молекулами.

2. G_s- или G_i-белки играют роль первичных посредников (рис. 4.4).

3. Белок-эффектор аденилатциклаза (АЦ) катализирует реакцию образования из АТФ 3', 5' цАМФ – вторичного посредника (рис. 4.5).

Он выполняет роль аллостерического активатора протеинкиназы А (индекс «А» от англ. сАМР).

Аденилатциклаза (интегральный белок, имеющий 12 трансмембранных доменов) обнаружена во всех тканях и органах. Выявлено 8 ее изоформ, из которых 4 являются Са²⁺-активируемыми.

4. Протеинкиназа А принимает сигналы от аденилатциклазы. Фермент состоит из четырех субъединиц. Два регуляторных (R) и два католитических (С) протомера образуют структуру R₂C₂ (рис. 4.7). Связываясь обратимо с регуляторными субъединицами, 3', 5' цАМФ вызывает диссоциацию комплекса (C₂R₂ → цАМФ₄R₂ + C + C). Освобождающиеся отдельно друг от друга две каталитические субъединицы фактически и являются активной протеинкиназой. Она фосфорилирует различные белки, включая ферменты, и изменяет их активность (ковалентная модификация). См. рис. 4.6.

5. Фосфодиэстераза, катализирует дециклизацию 3', 5' цАМФ (рис. 4.6) с образованием просто АМФ. Ингибиторами ее являются ураты, ксантины, кофеин, теофиллин, теобромин.

6. Фосфопротеинфосфатаза, возвращающая белки, ранее фосфорилированные протеинкиназой «А», в нативное состояние (рис. 4.6). Ее активность повышается под действием инсулина.

Два последних фермента обрывают передачу сигналов по аденилатциклазному пути.

Рис. 4.5. Реакции, катализируемые аденилатциклазой и фосфодиэстеразой. 1 – ингибиторы фосфодиэстеразы (ураты, ксантины, кофеин, теофиллин, теобромин).

Рис. 4.6. Реакции, катализируемые протеинкиназой «А» с изменением активности белка и фосфопротеинфосфатазой, возвращающей белок в нативное состояние. 1 – инсулин, активирует фосфопротеинфосфатазу.

Гормоны, «работающие» по аденилатциклазному пути, могут передавать сигналы возбуждения и торможения (табл. 4.1).

Таблица 4.1.

Гормоны и другие сигнальные молекулы (информоны) – стимуляторы или ингибиторы аденилатциклазы.

Информоны – стимуляторы аденилатциклазы, передающие сигналы чарез Rs → Gs-белки	Информоны – ингибиторы аденилатциклазы, передающие сигналы через Ri → Gi-белки
Некоторые либерины гипоталамуса (кортиколиберин, тиреолиберины, соматолиберин) Большинство тропинов гипофиза (кортикотропин, тиреотропин, фоллитропин, лютропин, липотропин, меланотропин) Кальцитонин Паратирин Глюкагон Секретин Адреналин, норадреналин (через β1, β2-адренорецепторы) Вазопрессин (через V2-рецепторы) Гистамин (через Н2-рецепторы) Холецистокинин Gip (желудочно-интестинальный пептид)	Соматостатин Pg Е1 (простагландин Е1) Энкефалины, эндорфины Адреналин, норадреналин (через α2-адренорецепторы) Ацетилхолин (через М-холинорецепторы) Гистамин (через Н2-рецепторы) Ангиотензин II

Как же работает аденилатциклазная система?

Гормон взаимодействует с рецептором. Образующийся гормон-рецепторный комплекс передает сигнал G-белку, а он, претерпевая ряд изменений (рис. 4.4), активирует аденилатциклазу. Последняя нарабатывает 3', 5' цАМФ (рис. 4.5).

Молекулы 3', 5' цАМФ обратно связываются с регуляторными субъединицами протеинкиназы А (рис 4.7) и ее активируют.

Активная протеинкиназа фосфорилирует специфические белки и в том числе ферменты.

Так, если это был сигнал глюкагона или адреналина через β₁, β₂-адренорецепторы, в гепатоцитах фосфорилируется гликогенсинтаза, становясь инертной, и киназа фосфорилазы, затем активирующая гликогенфосфорилазу. В итоге биосинтез гликогена замедляется, а распад ускоряется (рис. 4.7).

Реализация сигнала завершается дециклизацией 3', 5' цАМФ фосфодиэстеразой (рис. 4.5) и дефосфорилированием белков (ферентов) фосфопротеинфосфатазой (рис. 4.6).

Рассмотренный механизм передачи сигнала является многостадийным, что обеспечивает его амплификацию, т. е. многократное усиление. Даже единственная молекула гормона способствует в образовании огромного числа 3', 5' цАМФ, которые, в свою очередь, активируют еще больше молекул протеинкиназы А. Одна молекула этого фермента фосфорилирует множество молекул белков. В итоге меняется активность тысяч молекул ферментов.

Рис. 4.7. Схема аденилатциклазного пути мембранно-цитозольного механизма передачи сигналов (на примере сигнала глюкагона, адреналина в печени, мышцах)

2. Не оправдал ожидания гуанилатциклазный путь передачи информации. Предполагали, что его используют многие сигнальные молекулы, а их оказалось лишь несколько (атриальный, натрийуретический фактор (АНФ) или еще его называют атриопептин, натрийуретический пептид из мозга, кишечный пептид гуанилин, термостабильный токсин грамотрицательных бактерий, оксид азота (NO˙)).

Различабт четыре формы гуанилатциклазы. Три из них структурированы в плазматические мембраны и играют роль белков-рецепторов первого типа. При этом гуанилатциклазной активностью обладает внутриклеточный домен. Связывание гормона с экстрацеллюлярным доменом-рецептором приводит к активированию внутриклеточного активного центра.

В цитозоле есть еще одна растворимая форма гуанилатциклазы. В качестве простетической группы она содержит гем, с которым связывается самая простая межклеточная сигнальная молекула NO˙ (оксид азота).

Все формы гуанилатциклазы синтезируют 3', 5' цГМФ по схеме, аналогичной образованию 3', 5' цАМФ из АТФ (рис. 4.5).

А какими возможностями располагает 3', 5' цГМФ?

Их условно выделяют три:

а) он активирует протеинкиназу G (от англ. GMP)

Протеинкиназа G состоит из 2-х субъединиц, каждая из которых имеет два центра связывания 3', 5' цГМФ. Конформационные изменения молекулы фермента после присоединения 3', 5' цГМФ повышают его активность. Он начинает интенсивно катализировать фосфорилирование различных белков по радикалам серина, треонина (рис. 4.8).

Рис. 4.8. Схема активирования протеинкиназы G и ее каталитическая активность.

б) 3', 5' цГМФ регулирует активность фосфорилазы, которая дециклизует 3', 5' цАМФ и, следовательно, контролирует его уровень

в) активируя Са²⁺-АТФ-азу и снижая эффективность работы Са²⁺-каналов в мембранах, 3', 5' цГМФ способствует снижению уровня Са²⁺ в цитоплазме клеток

Некоторые из этих эффектов присущи NO˙ - сигнальной молекуле (рис. 4.9). Она образуется в клетках многих тканей и органов при катаболизме аргинина. В состав фермента нитроксидсинтазы, катализирующей синтез NO˙, входят ФМН, ФАД, гем, ТГБП, Zn²⁺. В реакции участвует НАДФ·Н + Н⁺. Ацетилхолин стимулирует образование оксида азота, из чего следует, что она может опосредоваться нервной регуляцией. Он также активнее нарабатывается в ответ на механическое воздействие на стенки кровеносных сосудов при повышении кровяного давления. Образуясь в эндотелиальных клетках, NO˙ диффундирует в гладкомышечные. Там он взаимодействует с ионом железа, входящим в гем цитозольной гуанилатциклазы и активирует ее. Нарабатываемый 3', 5' цГМФ, воздействуя на протеинкиназу G, увеличивает поток Са²⁺ наружу и этим инактивирует киназу легких цепей. В итоге наступает мышечная релаксация и расширение сосудов. Возник повод называть оксид азота эндотелиальным релаксирующим фактором (ЭРФ, от англ. Endotelium-Drived Relaxing Factor, EDRF). На этом основано применение нитровазодилататоров (нитроглицерин, нитропруссид, аэрозоль изокет^®, содержащая изосорбида динитрат и др.) для купирования загрудинных болей при стенокардии, инфаркте миокарда и т. д. Они медленно высвобождают NO˙, вызывая тем самым расслабление сосудов и улучшение кровоснабжения сердца.

Рис. 4.9. Схема, иллюстрирующая участие NO˙-сигнальной молекулы в расслаблении гладких мышц.

3. Гормоны и другие сигнальные молекулы, использующие фосфоинозитидный путь, представлены в табл. 4.2.

Таблица 4.2.

Сигнальные молекулы, действующие по фосфоинозитидному пути

Гормоны	Прочие сигнальные молекулы
Тиреолиберин Гонадолиберин Соматотропин Вазопрессин (через V1-рецепторы) Окситоцин Адреналин (через α1-адренорецепторы)	Ангиотензин II Брадикинин Гастрин Холецистокинин ВИП Ацетилхолин (через М-холинорецепторы)

Важным моментом в передаче сигналов по этому пути является активирование фермента фосфолипазы С, которая расщепляет минорные фосфолипиды плазматических мембран фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфаты (рис. 4.9). Образующиеся диацилглицеролы (ДАГ) и 1, 4, 5-трифосфоинозитолы (ИФ₃) играют роль вторичных посредников.

Как и в случае аденилатциклазного механизма первичными посредниками здесь являются G-белки, но не абсолютно те же, а несколько отличающиеся – G_plc-белки.

ДАГ и ИФ₃ инициируют в клетках-мишенях два отдельных каскадных механизма (рис. 4.10). ДАГ, оставаясь в плазматической мембране, активирует протеинкиназу С.

В структуре этого фермента выделяют два домена: регуляторный и каталитический. Первый, имея высокое сродство к ионам кальция и максимально активируясь в его присутствии, присоединяет ДАГ. Конформационные изменения затрагивают каталитическую субъединицу и фермент становится активным. Протеинкиназа С фосфорилирует белки, имеющие отношение к пролиферации клеток (белки цитоскелета и ядерного хроматина, митогены, факторы роста). Следует отметить, что уровень Са²⁺ в цитозоле клеток зависит от второго внутриклеточного посредника (ИФ₃), хотя он и сам по себе является вторичным посредником.

Каким образом ИФ₃ повышает содержание Са²⁺ в цитозоле клеток? ИФ₃ усиливает его мобилизацию из цистерн эндоплазматического ретикулума, а, превращаясь в 1, 3, 4, 5-инозитолтетрафосфат (ИФ₄), открывает в плазматических мембранах «медленные» неэлектрогенные лиганд-зависимые кальциевые каналы, обеспечивая поступление Са²⁺ в клетки из внеклеточного матрикса в цитоплазму.

Действие Са²⁺ опосредовано специальными Са²⁺-вязывающими белками кальмодулином, аннексином. Кальмодулин представляет из себя белок (Mr 17 кДа), имеющий четыре участка связывания Са²⁺. При повышении уровня этого иона в цитозоле до ≥10^-5 моль/л образуются активные Са²⁺-кальмодулиновые комплексы, способные изменять функциональное состояние разных белков. Они активируют кальций-зависимые аденилатциклазу и гуанилатциклазу, а в некоторых типах клеток, стимулируя фосфодиэстеразу, гасят сигналы, передаваемые по аденилатциклазному пути. Кроме того, Са²⁺-кальмодулиновые комплексы активируют различные протеинкиназы, в том числе протеинкиназу С, которые, например, в гладких мышцах фосфорилируют легкие цепи миозина и инициируют их сокращение. В париетальных клетках стенки желудка киназы фосфорилируют и этим стимулируют функцию Н⁺, К⁺-АТФ-азы, обеспечивающей секрецию Н⁺ для последующего образования HCl. В разных тканях Са²⁺-зависимая протеинкиназа активирует киназу липомодулина. Этот мембранный белок повышает активность фосфолипазы А₂ и стимулирует в конечном итоге биосинтез эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов, лейкотриенов).

В мышцах Са²⁺ активирует особую форму киназы фосфорилазы В, стимулирующую гликогенолиз. Этот механизм реализуется адреналином через α₁-адренорецепторы.

Терминация эффектов кальмодулина происходит при его взаимодействии с кальций-связывающими белками типа кальцийнейрина. Кроме того, сам Са²⁺ активирует Са²⁺-АТФ-азу, обеспечивающую удаление его туда, откуда он поступал в цитозоль (ВКМ, цистерны ЭР). И, наконец, вторичные посредники ИФ₃ и ДАГ могут удаляться путем вовлечения в ресинтез минорных фосфатидилинозитолов. Все это приводит к прекращению передачи гормонального сигнала.

Рис. 4.10. Фосфоинозитидный путь действия сигнальных молекул: Pg – простагландины; Lt – лейкотриены; Tx – тромбоксаны; Pg I₂.

4. Путь включения Са²⁺ неэлектрогенных медленных каналов.

Уже отмечено в предыдущем разделе, что эти каналы в плазматических мембранах открываются под воздействием инозитол-1, 3, 4, 5-тетрафосфата (ИФ₄). Однако в ряде случаев эти каналы могут включаться напрямую гормон-регуляторными комплексами или через G-белки. Таких информонов известно несколько (табл. 4.3).

Таблица 4.3.

Информоны, напрямую действующие на медленные неэлектрогенные Са²⁺ каналы.

Гормоны	Другие информоны
Соматолиберин Тиреолиберин Гонадолиберин Вазопрессин (через V1-рецепторы)	Гастрин Холецистокинин

Данный путь накопления Са²⁺ в клетке является менее эффективным, чем фосфоинозитидный, но при достижении уровня Са²⁺ в цитозоле ≥ 10^-5 моль/л их эффекты совпадают (см. раздел №4, стр. ).

5. Тирозинкиназный путь.

Его включают рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью (см. рецепторы первого типа, рис. 4.1, 4.12, 4.14), или инициирующие ее у других белков (рис. 4.15). Уникальность этих протеинкиназ состоит в том, что они фосфорилируют белки не по остаткам серина, треонина, как это традиционно делают другие протеинкиназы, а по радикалам тирозина. Рецепторы – собственно тирозинкиназы (инсулиновый, фактора роста эпидермиса и др.) активируют необычный сигнальный путь (Ras-путь), особенностью которого является отсутствие низкомолекулярных вторичных посредников. Все его участники представлены белками. Один из них Ras G-белок, давший название всему пути. Это небольшой мономерный ГТФ-связывающий белок, обладающий ГТФ-азной активностью. В неактивном состоянии Ras-белок прикреплен к внутренней поверхности плазматической мембраны и связан с ГДФ. В активной его форме ГДФ заменен на ГТФ.

Как же реализует инсулин свою информацию в клетках-мишенях?

а) После связывания с гормоном рецептор аутофосфорилируется по тирозиновым радикалам и активируется.

б) Это приводит к фосфорилированию находящихся в цитоплазме белков-субстратов инсулинового рецептора (IRS). См. рис. 4.11. Известны разные их варианты.

в) Эти субстраты инициируют в клетках несколько видов дальнейших превращений. Один из них связан с активированием Ras G-белков. При этом образуется комплекс, включающий четыре компонента: 1 – фосфорилированный инсулиновый рецептор (IR-тир-О-Р); 2 – фосфорилированный субстрат инсулинового рецептора (IRS-тир-О-Р); 3 – GEF; 4 – SOS-белок (сокращеня расшифрованы в комментариях к рис. 4.11). Комплекс инициирует изменения, происходящие дальше с Ras G-белками. Вначале в Ras G-белке происходит замена ГДФ на ГТФ. Это очень похоже, хотя и не полностью, на активирование G-белков, ассоциированных с рецепторами третьего типа (рис. 4.4). Ras-ГТФ-белок обладает ГТФ-азной активностью, то есть он сам себя постепенно инактивирует и возвращается в инертную форму (Ras-ГДФ-белок). Показано, что ГТФ-азная его активность стимулируется специальным GAP – 5. См. рис. 4.11.

Рис. 4.11. Схема активирования и последующего аутоинактивирования Ras G-белка.

1 - фосфорилированный инсулиновый рецептор (IR-тир-О-Р); 2 - фосфорилированный субстрат инсулинового рецептора (IRS-тир-О-Р от англ. Insuline Receptor substrate); 3 – GEF, осуществляющий обмен ГТФ (от англ. GTF-ase Exchange Factor); 4 – SOS-белок (от англ. Son of Sevenless – белок, участвующий в этом сигнальном пути, получивший название по имени соответствующей мутации гена (Sevenless mutation) у мушки дрозофилы; 5 – GAP от англ. GTP-ase Activatiny Protein.

г) На пике своей активности Ras ГТФ-белок фосфорилирует и этим стимулирует функцию следующего компонента Raf-1-белка, представляющего из себя протеинкиназу серин-треонинового типа. Raf-1-белок в неактивном состоянии находится в цитозоле. Он комплексирован с шаперонами. Его активирование Ras ГТФ-белком – сложный многоэтапный процесс.

д) Активная Raf-киназа стимулирует каскад реакций фосфорилирования по серин/треониновому типу. Изменяется функциональное состояние нескольких белков, в частности, митоген активируемых протеинкиназ (МАП). Последние активируются в две стадии: вначале фосфорилируется киназа МАП, а потом ею активируются и они сами.

е) Мишенями МАП являются белки-эффекторы, также как протеинкиназа рр90S6, фосфорилаза А₂, белки рибосом, а также переносчики сигнала и активаторы транскрипции (ПСАТ). В их число входят Gun-, Fos-факторы и др.

Здесь следует отметить, что Gun-, Fos-факторы, как и ранее упоминавшиеся Ras- и Raf-белки, обязаны своими необычными названиями ретровирусным онкогенам. Оказалось, что эти онкогены имеют в нормальных клетках своих «двойников». И хотя эти нормальные гены кодируют белки Ras-пути, назвали их по онкогенам вирусов.

ж) После димеризации и транслокации в ядро ПСАТ выступают в роли индукторов, узнающих энхансеры. Этим они стимулируют транскрипцию генов, клеточную пролиферацию и дифференцировку.

Инсулин влияет на скорость транскрипции более чем 100 мРНК в клетках печени, скелетных мышц, сердца, жировой ткани.

Обращает внимание, что некоторые факторы транскрипции являются ее репрессорами, узнающими сайленсеры на ДНК. Тогда биосинтез мРНК и соответствующих белков замедляется. Инсулин таким способом подавляет образование фосфоенолпируваткарбоксикиназы и блокирует глюконеогенез.

Окончание гормонального действия через инсулиновые рецепторы наступает под влиянием протеинфосфатаз, возвращающих их в неактивное состояние или их фосфорилирование протеинкиназами по радикалам серина и треонина, их сродство к инсулину.

Еще одним путем снижения чувствительности клеток к инсулину является захватывание ими комплексов рецептор-инсулин внутрь эндоцитозом. Часть рецепторов потом возвращается обратно в мембрану, а часть расщепляется лизосомальными протеиназами.

з) Одной из особенностей Ras-пути является его взаимодействие в нескольких точках с другими регуляторными путями. Так Raf-1-белок может активироваться не только Ras ГТФ-белком, но и протеинкиназой С – ферментом участником фосфоинозитидного пути (рис. 4.10). И, напротив, некоторые протеинкиназы Ras-пути могут иметь в качестве мишеней белки альтернативных регуляторных механизмов.

Например, протеинкиназа рр90S6 каскадного этапа Ras-пути рр90S6 стимулирует функцию протеинфосфатазы, которая затем фосфорилирует киназу гликогенфосфорилазы, гликогенфосфорилазу, гликогенсинтазу – регуляторные ферменты метаболизма гликогена по аденилатциклазному пути. Распад гликогена в печени под действием инсулина замедляется, а биосинтез ускоряется. Уже было отмечено, что митогенактивируемые протеинкиназы (МАП) стимулируют функцию фосфорилазы А₂, обеспечивающей образование эйкозаноидов. Это сближает эффекты тирозинкиназного и фосфоинозитидного путей передачи сигналов. Вторичные посредники последнего (ИФ₃, ИФ₄, Са²⁺) через киназу липомодулина также активируют фосфорилазу А₂ (рис. 4.10).

Обнаружена способность субстратов (IRS), активируемых инсулин-рецепторным комплексом, стимулировать функцию фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-3-киназы). Через ряд стадий это приводит к образованию минорных фосфофосфатидилинозитолов и повышению уровня вторичных посредников фосфоинозитидной сигнальной системы ФИ₃, ФИ₄, Са²⁺ (рис.4.10).

Считают также, что ФИ-3-киназа в адипоцитах активирует фосфодиэстеразу. Это приводит к торможению липолиза за счет уменьшения внутриклеточной концентрации вторичного посредника аденилатциклазного пути 3'5' цАМФ. ФИ-3-киназа принадлежит способность в мышцах и жировых клетках ускорять встраивание белков транспортеров глюкозы четвертого типа (Глют-4) в плазматические мембраны и стимулировать облегченную диффузию глюкозы из крови в клетки. Уровень глюкозы в крови снижается (рис. 4.13). На жировых клетках было показано, что встраивание Глют-4 завершается уже через 7 минут после связывания инсулина с рецепторами. После удаления инсулина процесс обращается, и через 20 – 30 минут транспортные белки выходят из мембраны в цитоплазму.

Рис. 4.13. Мобилизация Глют-4 под действием инсулина в клетках скелетных мышц и жировой ткани. 1 – инсулиновый рецептор; 2 – гормон инсулин; 3 – Глют-4 в цитозольных везикулах; 4. После образования гормон-рецепторного комплекса везикулы перемещаются к плазматической мембране, сливаются с ней и встраивают Глют-4 в мембрану. После этого происходит облегченная диффузия глюкозы в клетки.

Рис. 4.12. Краткая схема Ras-пути, сигнальных молекул, передающих информацию через рецепторы, ассоциированные с тирозинкиназой, на примере инсулина. Буквами а, б, в, г, д, е, ж, з обозначены основные стадии Ras-пути, характеристика которых дана в тексте (стр. )

IRS – субстрат инсулинового рецептора; Глют-4 – белок-транспортер глюкозы (глюкозный транспортер-4); ФИ₃ – инозитол-1, 4, 5-трифосфат; ФИ₄ – инозитол-1, 3, 4, 5-тетрафосфат; SOS-белок – (от англ. Son of Sevenless), названный по мутации гена у мушки дрозофилы; Gun-, Fos-факторы, Ras-, Raf –белки получили свои названия по названиям ретровирусных онкогенов, «двойниками» которых они оказались в нормальных клетках; МАП – митоген, активирующий протеинкиназу; ПСАТ – переносчики сигнала и активаторы транскрипции.

Глюкозные транспортеры (Глют-4) обнаружены во всех тканях, инсулинзависимые – в жировой и мышечной. Различают их несколько типов (табл. 4.4).

Таблица 4.4.

Типы белков транспортеров глюкозы, их локализация и функции.

Типы Глют	Распределение Глют по клеткам тканей и органов	Функции разных Глют
1 2 3 4 5	Головной мозг, почки, толстый кишечник, плацента, эритроциты Печень, почки, энтероциты, β-клетки поджелудочной жедезы Головной мозг, почки, плацента и др. Скелетные мышцы, жировая ткань, сердце Тонкий кишечник	Стабильная облегченная диффузия глюкозы в клетки этих тканей Облегченная диффузия глюкозы из клеток этих тканей в кровь Стабильная облегченная диффузия глюкозы в клетки тканей, но более интенсивная, чем с участием Глют-1, т. к. Глют-3 обладает к ней повышенным сродством Стимулируемая инсулином облегченная диффузия глюкозы из крови в клетки (см. рис. 4.13) Трансмембранный транспорт глюкозы эпителиальными клетками, осуществляющими всасывание

Иначе выглядит инициация Ras-пути у ЭФР.

а) Связывание сигнальной молекулы вызывает димеризацию рецептора (рис. 4.14) и его аутофосфорилирование (1).

б) С фосфотирозинами рецепторов взаимодействует (2) SH2-домен белка переносчика сигнала (SH2БПС), который связан с так называемым (3) SOS-белком (см. рис. 4.14).

в) Образовавшийся тройной комплекс: (1) димер фосфорилированного рецептора ЭФР/(2) SH2БПС/(3) SOS-белок активирует Ras-G-белок (рис. 4.11). Дальнейшая передача сигнала вплоть до генома реализуется по Ras-пути (рис. 4.14), этапы которого во многом совпадают с таковыми у инсулина.

Рис. 4.14. Краткая схема активирования Ras-пути эпидермальным фактором роста (ЭФР). 1 – фосфорилированный рецептор ЭФР после димеризации; 2 - SH2БПС – белок переносчик сигнала, имеющий в структуре SH2-домен, узнающий остатки тирозина; 3 - SOS-белок (от англ. Son of Sevenless), названный по мутации гена у мушки дрозофилы. Буквами а, б, в обозначены начальные этапы инициации Ras-пути ЭФР, характеристика которых дана в тексте.

Рецепторы, передающие сигналы таких гормонов как соматостатин, пролактин, а также почти всех цитокинов, хотя и реализуют их по тирозинкиназному пути, при этом сами ферментами не являются и, следовательно, не обладают способностью к аутофосфорилировнию. Их фосфорилируют другие тирозинкиназы. Ими часто являются так называемые Янус-киназы, имеющие два активных центра (от «двуликий Янус», т. е. проявляющийся в двух лицах). Они принадлежат к протеинкиназам особого ЯК-семейства.

Участие рецепторов в передаче сигналов происходит по пути димеризации или без нее. По первому варианту активируются, например, рецепторы соматостатина. Они представляют из себя белки (Mr 70 кДа) с одним трансмембранным доменом (рис 4.15).

а) После связывания с ними гормона молекулы рецепторов ассоциируют, образуя гомодимеры.

б) Последние через белки-переносчики сигналов (SH2БПС) активируют Янус-киназы. В клетках тканей и органов обнаружено несколько типов SH2БПС. Их условно называют белки GP 130, β_с, γ_с и др. Одинаковые спектры биологической активности у разных сигнальных молекул объясняют тем, что они активируют одни и те же SH2БПС. И наоборот, отличающиеся эффекты одного и того же гормона могут объясняться участием разных SH2БПС.

в) Янус-киназы фосфорилируют по тирозиновым радикалам и себя (аутофосфорилирование), и цитоплазматические домены рецепторов, и различные белки. У соматостатина таким белком может быть и фосфокиназа С. Она, как известно, участвует в передаче сигналов по фосфоинозитидному пути (рис. 4.10).

г) В итоге повышается уровень ДАГ, ИФ₃, Са²⁺ - вторичных посредников (рис. 4.10)

д) Янус-киназы могут фосфорилировать и факторы транскрипции, называемые часто переносчиками сигнала и активаторами транскрипции (ПСАТ или STAT (от англ. Signal Tranducers and Activators of Transcription)). После димеризации и транслокации в ядро ПСАТ (STAT) в качестве фактора транскрипции связывается с энхансерами генов и активируют их транскрипцию. Этот финал «работы» Янус-киназ характерен для большинства цитокинов, в том числе интерлейкинов, интерферонов, факторов некроза опухолей, колониестимулирующих факторов и др. В итоге они контролируют рост и дифференцировку клеток, отвечают за биосинтез белков острой фазы и т. д.

Рис. 4.15. Передача сигналов по тирозинкиназному пути через рецепторы, лишенные ферментативной активности и Янус-киназы. Буквами а, б, в, г обозначены основные стадии реализации сигнала соматотропина. Буквами а, б, д обозначены основные стадии реализации сигнала цитокинов, характеристика которых дана в тексте.

6. Путь, включающий электрогенные (потенциалзависимые) ионные каналы.

Связывание лиганда ведет к открыванию каналов Na⁺, K⁺, Cl¯. По такому механизму нейромедиаторы, такие как ацетилхолин (через N-холинорецепторы – Na⁺ и K⁺-каналы), γ-аминомасляная кислота (ГАМК через А-рецепторы - Cl¯-каналы), β-аланин, глицин, серотонин в центральных и периферических синапсах. Этот путь рассматривается в теме: «Биохимия нервной системы».

II. Внутриклеточно-ядерный механизм.

Местом действия липофильных гормонов являются ядра клеток-мишеней, где они регулируют экспрессию генов на стадии инициации транскрипции. В итоге синтезируются новые мРНК, новые белки, реализующие клеточный ответ. Гормоны после проникновения в клетки-мишени связываются со своими рецепторами, которые находятся или в цитозоле (глюкокортикоиды, минералокортикоиды, 1, 25(ОН)₂D₃, 24, 25(OH)₂D₃) или в ядре (эстрогены, андрогены, прогестерон, Т₃, Т₄). Рецепторы гормонов, являясь гликопротеинами, принадлежат к группе релких белков. Присутствуя в клетках-мишенях в количестве 10³ – 10⁴ молекул, они характеризуются высоким сродством к гормонам и у разных из них существенно отличаются. Так, рецепторный белок для кортизола имеет Mr 67 кДа, а для эстрадиола – Mr 200 кДа. В последнем случае он состоит из двух субъединиц.

В неактивном состоянии рецепторы связаны с белками-протекторами (шаперонами – Ш 90 или shp 90).

Особенностью этих белков является высокое сродство к гидрофобным радикалам аминокислот. Они обеспечивают вновь синтезированным белкам правильное пострибосомальное созревание (англ. shaperon – буквально пожилая дама, сопровождающая молодую девушку на балах, а также спутник, компаньон), снижая вероятность возникновения ошибок. В зависимости от молекулярной массы выделяют Ш 40, Ш 60, Ш 70, Ш 90 и др. Различают конститутивные и индуцибельные формы шаперонов. Синтез вторых усиливается при повышении температуры тела и других проявлениях стресса. В этой связи их еще называют белками теплового шока (англ. heat shock proteins – hsp 60, hsp 70, hsp 90 и т. д.).

Помимо участия в посттрансляционном процессинге, шапероны:

а) участвуют в завершающем этапе существования белков, обеспечивая их разворачивание при денатурации, с которой начинается их катаболизм;

б) направляют белки в протеасомы и лизосомы для их разрушения;

в) переносят белки через биомембраны;

г) инициируют апоптоз;

д) участвуют в превращениях конструктивных прионовых белков (Pr, Pc) в патологические их конформации – белки в форме, (Pr, Pc), инициирующие ряд прионовых болезней;

е) связываясь с рецепторами липофильных гормонов, они их стабилизируют.

Образование гормон-рецепторных комплексов влечет за собой конформационные перестройки молекул рецепторных белков и диссоциацию от шаперонов. Если это произошло в цитозоле, комплекс перемещается в ядро. Там молекулы рецепторов объединяются в димеры, обладающие повышенным сродством к ДНК. Нередко процессы активирования рецепторов сопряжены с их фосфорилированием.

Важным этапом в передаче гормональных сигналов является связывание гормон-рецепторных комплексов с двунитевой ДНК. Это происходит в регуляторных участках генов, получивших название гормон-чувствительные элементы (ГЧЭ). Последние, выступая в роли энхансеров, могут стимулировать транскрипцию, а являясь сайленсерами, ее подавляют.

Функции ГЧЭ выполняют короткие симметричные фрагменты ДНК (палиндромы). Молекулы рецепторных белков включают несколько доменов, имеющих разное предназначение: регуляторный ДНК-связывающий, сайтспецифичный и С-терминальный гормонсвязывающий. В ДНК-связывающем домене содержатся аминокислотные последовательности, образующие два цинковых кластера (или иначе два «цинковых пальца»). Один из них отвечает за связь рецептора с палиндромами ДНК, второй за димеризацию рецептора. В каждом «цинковом пальце» атом цинка связан с 4 остатками цистеина (рис. 4.14).

Рис. 4.14. Структура цинкового пальца в белке-рецепторе, ответственная за связывание с ГЧЭ ДНК.

Рецепторы тиреоидных гормонов относят к факторам транскрипции. Они всегда на ДНК. В отсутствие гормонов они играют роль репрессоров, а при их поступлении инициируют экспрессию соответствующих генов.

Обсуждение внутриклеточно-ядерного механизма передачи гормональных сигналов можно завершить кратким изложением последовательности событий, приводящих к активированию транскрипции (рис. 4.15).

• Гормон поступает в клетку-мишень, преодолевая билипидный слой плазматической мембраны.

• Взаимодействие гормона с рецептором приводит к его конформационным изменениям и снижению сродства к hsp 90, который отделяется от гормон-рецепторного комплекса.

• Если комплекс образовался в цитоплазме, он перемещается через поры в ядро, и там происходит димеризация рецепторов.

• Димер взаимодействует с ГЧЭ ДНК (энхансером или сайленсером).

• Это способствует увеличению (при взаимодействии димера с энхансером) или снижению (в случае взаимодействия димера с сайленсером) доступности промотора для РНК-полимеразы.

• Скорость транскрипции структурных генов увеличивается или уменьшается.

• Аналогично изменению транскрипции меняется скорость трансляции на рибосомах.

• Изменяется содержание соответствующих белков в том же типе ферментов, что сказывается на метаболических процессах и функциональном состоянии клетки. Возникает клеточный ответ.

Эффекты липофильных гормонов проявляются не сразу, так как для осуществления матричных биосинтезов (транскрипция, трансляция) требуется время (десятки минут, часы).

Рис. 4.15. Схема реализации сигналов липофильными гормонами (на примере кортизола).

Терминация рецепторного цикла липофильных гормонов наступает при распаде тройного комплекса гормон/рецептор/ГЧЭ. Вопрос «когда и как это происходит» остается дискуссионным. Есть несколько вариантов его решения:

а) Значительное повышение количества мРНК приводит к ее конкуренции с ДНК за гормон-рецепторный комплекс. Вытесняя его из ГЧЭ ДНК, мРНК временно транслирует процесс.

б) Инактивация рецептора путем его фосфорилирования протеинфосфатазами.

в) Протеолиз рецептора ядерными протеиназами.

г) Необратимой ферментативной инактивации может подвергаться и сам гормон. Такая возможность наиболее вероятна в печени.

Задание 4.1.

1. Дайте характеристику типам рецепторов, обеспечивающих передачу гормональных сигналов.

2. Назовите пути передачи сигналов по мембранно-цитозольному механизму.

3. Составьте схемы, отражающие последовательностьсобытий при передаче информации сигнальными молекулами по аденилатциклазному и фосфоинозитидному путям.

4. Перечислите этапы Ras-пути тирозинкиназного механизма на примере передачи сигналов инсулина.

5. Ответьте на вопросы:

• Почему мембранно-цитозольный механизм передачи информации называют косвенным, а внутриклеточно-ядерный – прямым?

• Каких ижиданий не оправдал гуанилатциклазный механизм?

• Аденилатциклаза и гуанилатциклаза кактлизируют идентичные реакции. А в чем их отличия?

• Какую роль играет гуанилатциклаза в реализации информации NO˙-сигнальных молекул?

• В чем сходства и отличия аденилатциклазного и фосфоинозитидного путей мембранно-цитозольного механизма?

• В чем отличия тирозинкиназной активности, проявляемой белками при передаче сигналов инсулина, эпидермального фактора роста (ЭФР), соматотропина?

• Какое отношение имеют белки-шапероны к липофильным гормонам?

• Что такое гормончувствительный элемент (ГЧЭ)?

• Почему эффекты липофильных гормонов проявляются не мгновенно?

• Как прекращается передача сигналов гормонов, передающих их по внутриклеточно-ядерному механизму?

Задание 4.2.

Решите тесты:

• Инозитолтрифосфаты как внутриклеточные посредники:

А. Активируют фосфокиназу С

Б. Образуются из минорных фосфолипидов плазматических мембран фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфатов

В. Усиливают мобилизацию Са²⁺ из цистерн эндоплазматического ретикулума

Г. Может превращаться в 1, 3, 4, 5-инозитолтетрафосфат

Д. Состоит из трех субъединиц

• Указанные группы гормонов:

1. Проникают в клетки-мишени из крови 2.Изменяют активность метаболических процессов 3. Реализуют свои сигналы, взаимодействуя с белками-рецепторами 4. Участвуют в построении биомембран 5. Не проникают в клетки-мишени

А. Белково-пептидные Б. Стероидные В. И те, и другие Г. Ни один из них

• Гормоны:

А. Секретируются в ответ на специфические стимулы

Б. Каждый из них влияет на метаболизм в любых клетках организма

В. Могут реализовывать свои сигналы без участия белков-рецепторов

Г. Образуются в клетках-мишенях

Д. Все имеют первичных и вторичных посредников передачи информации

• Гормоны передают свои сигналы через рецепторы:

Атриопептин Глюкагон Соматотропин Трийодтиронин Инсулин

А. Рецепторы, передающие сигналы с участием Янус-киназ Б. Внутриядерные рецепторы В. Рецепторы с тирозинкиназной активностью Г. Рецепторы с гуанилатциклазной активностью Д. Нет правильного ответа

• Оцените достоверность утверждений в каждом предложении и связь между ними:

• Янус-киназы, участвуя в передаче гормональных сигналов по гуанилатциклазному пути, активируют факторы транскрипции ПСАТ, фосфорилируя их по радикалам серина, потому что они имеют один активный центр.

• Ras-G-белки подобно α-субъединицам G-белков обладают ГТФ-азной активностью, поэтому они являются участниками Ras-пути передачи гормональных сигналов.

• Для передачи гормональных сигналов липофильными гормонами характерно:

А. Взаимодействие с внутриклеточными белками-рецепторами

Б. Участие в процессе трансляции белков

В. Образование 3', 5' цАМФ

Г. Проникновение в клетки-мишени

Д. Инициация репликации ДНК

Задание 4.3.

Решите задачу:

У больного стала возникать сильная боль за грудиной, усиливающаяся при ходьбе и физических нагрузках. Пациент при этом останавливается и при этом боль может утихнуть через несколько минут. Иногда боль появляется при волнении и вне связи с физическими напряжениями. Периодически боль стала появляться даже ночью. Больной просыпается с чувством страха и остается неподвижным, опасаясь ее усиления.

Характерным для этих приступов оказалось то, что они быстро купируются после приема под язык нитроглицерина.

Примите решение относительно заболевания пациента. Объясните механизм лечебного эффекта нитроглицерина.